Estudio de la expresión diferencial génica sobre líneas celulares de cáncer de mama en presencia de withanolido D

En este trabajo se planteó un estudio comparativo de los cambios de expresión génica inducidos por el Withanólido D en la línea celular MCF-7 que expresa el receptor de estrógenos, presenta una forma funcional de p53 y es altamente sensible a fármacos; y la línea MDA-MB231, que no expresa el receptor de estrógenos y posee p53 mutado. Para esto se realizó un seguimiento en el tiempo o “time-course” evaluando los cambios de la expresión génica en múltiples puntos de tiempo (15 minutos, 1, 4, 8, 12 y 24 horas) bajo diferentes concentraciones de Withanólido D (1, 5 ,10 y 20 μM). Mediante RT-PCR en tiempo real se siguieron los cambios a nivel transcripcional, realizando las amplificaciones para los catorce genes seleccionados con base en el estudio previo, que intervienen en procesos como ciclo celular, proliferación y muerte celular. Por medio de la agrupación jerárquica se identificaron cuatro patrones de expresión relacionados con las respuestas tempranas, continuas, transitorias y tardías de la expresión de los genes en ambas líneas celulares. Los resultados obtenidos de la expresión de Bcl-2 medido por RT- PCR en tiempo real, se correlacionaron con los cambios en la expresión de la oncoproteína Bcl-2 medida por inmucitoquimica, inducidos por los tratamientos con Withanólido D, observando que mediante ambas metodologías se presentó un patrón de expresión similar: en las células MCF-7, la expresión del ARNm para este gen aumentó, y en la expresión de la proteína también se observó un aumento. Esto indicó que la inmunocitoquímica es una metodología significativa para validar los resultados de expresión de ARN mensajero obtenidos por RT-PCR en tiempo real. En respuesta a un daño causado por Withanólido D, las células pueden inducir la activación de diferentes rutas de reparación del ADN y así activar la respuesta de cito-protección mediada por proteínas de choque térmico. Dado que además se vio interferencia del Withanólido D con la activación de rutas de reparación de ADN y la posterior reorganización de la cromatina y la segregación de los cromosomas, es posible plantear que se genera un estrés replicativo y un daño que la célula, a pesar de desencadenar y activar mecanismos de defensa, no logra contrarrestar este daño y como resultado es la muerte celular./Abstract: In the present work, we made a comparative study of changes in the expression of these genes induced by Withanolide D in two human breast cancer cell lines: MCF-7 which is strongly sensitive to drugs, ER+ and presents functional p53 status; and MDA MB231 which is ER- and presents p53 tumor suppressor gene mutated. Hence, a time-course was made to evaluate changes in gene expression at multiple points in time (15 min, 1, 4, 8, 12 y 24 hours) under different concentrations of Withanolide D from 1μM to 20μM. Using RT-PCR real time and High Resolution Melting (HRM); amplifications were done for fourteen genes which are involved in processes such as cell cycle, proliferation and cell death. Hierarchical clustering identified four time-related expression patterns which separated into early, continuous, transient and late responses patterns in both cell lines. The expression level of Bcl-2 was measured by RT-PCR real time and its protein expression was confirmed by immune cytochemistry. We observed to have similar late expression patterns in both assay in MCF-7 cells. The results of the Bcl-2 expression measured by RT-PCR in real time and the expression of Bcl-2 oncoprotein measured by immunocytochemistry that were induced by treatments with withanolide D were correlated. The expression patterns were similar using both methods in MCF-7 cells: the expression of mRNA for this gene increased, and the protein expression was also observed an increase. This indicated that immunocytochemistry is a significant methodology to validate the results of mRNA expression obtained by RT-PCR in real time. In response to damage caused by withanolide D, cells can induce the activation of different DNA repair pathways and activate the cyto-protective response mediated by heat shock proteins. As was also withanolide D interference with the activation of DNA repair pathways and the subsequent reorganization of chromatin and chromosome segregation, it is possible to argue that generates a replication stress and cell damage, despite to trigger and activate defense mechanisms, cells cannot counteract this damage caused by this potential antitumoral compound.Maestrí