Estudio metabólico de hojas de Passiflora ligularis y su relación con la actividad inhibitoria sobre α-amilasa y α-glucosidasa

Especies del género Passiflora han sido objeto de múltiples investigaciones farmacológicas, dado que existen reportes de su uso en el tratamiento tradicional de diferentes patologías, una de ellas la diabetes mellitus. Passiflora ligularis Juss o “Granadilla” es una especie ampliamente cultivada en el territorio nacional, cuyo fruto ha demostrado poseer actividad en diferentes modelos farmacológicos de diabetes. Por otro lado, se han identificado compuestos en hojas con actividad inhibitoria sobre las glucosil-hidrolasas, enzimas necesarias para la digestión de carbohidratos y dianas farmacológicas en el tratamiento de esta enfermedad. Basados en dichas evidencias, en esta tesis de maestría se buscó estudiar el perfil metabólico de extractos polares de hojas de P. ligularis, e identificar, a través de un estudio metabolómico, los metabolitos responsables de la actividad inhibitoria sobre estas enzimas involucradas en la digestión de carbohidratos. Finalmente, se buscó validar los resultados obtenidos mediante ensayos in vitro y estudios in silico. Así, mediante el perfilado metabólico por RMN-1H y HPLC-MS se identificaron 29 compuestos, 5 de los cuales corresponden a aminoácidos, 2 a carbohidratos, 4 a ácidos orgánicos, 3 a compuestos misceláneos, 1 saponina y 14 compuestos polifenólicos; entre estos últimos, los flavonoides tipo O-glicósido derivados de quercetina y crisina son los más abundantes. Se estudiaron hojas de 8 parcelas de cultivo ubicadas en los municipios de Anolaima, Algeciras, Junín; éstas fueron almacenadas bajo refrigeración o a temperatura ambiente. Los extractos obtenidos a partir de 25mg de hojas se ensayaron sobre los modelos de inhibición de α-glucosidasa presente en el extracto de intestino de rata y α-amilasa pancreática porcina, obteniéndose inhibiciones de entre el 5 y el 50%; y de entre el 5 y 95%, respectivamente. El estudio metabólomico por RMN-1H permitió establecer que la condición de almacenamiento es la variable que mayor impacta en los cambios del perfil metabólico de los extractos, específicamente cambios asociados con la composición de carbohidratos. Por otro lado, no se evidenció efecto del sitio o la edad de cultivo en la diferenciación de los perfiles metabólicos. Los análisis por OPLS-DA revelaron que los cambios en la actividad biológica se explicarían por variaciones en compuestos de tipo saponina, polifenol y aminoácido. Estudios in silico tipo acoplamiento molecular, entre los compuestos identificados como posibles responsables de los cambios de actividad inhibitoria, y las estructuras rígidas de las enzimas α-amilasa pancreática porcina y la subunidad N-terminal de la α-glucosidasa humana, permitieron identificar que los compuestos: ligularósido C (15), quercetina-3-O-glucósido (17), luteolina-7-O-glucósido (17a), kaempferol-3-O-glucósido (19), y apigenina-7-O-glucósido (19a), son los que generarían complejos con el sitio activo de la α-amilasa de forma más efectiva para inhibirla. En el caso de la α-glucosidasa, los compuestos quercetin-3-O-(6”-malonil)-glucósido (18), apigenina-7-O-glucósido (19a), kaempferol-3-O-(6”-malonil)-glucósido (21) e isoramnetin-3-O-(6”-malonil)-glucósido (22) fueron los que presentaron mejores resultados. Por otro lado, se determinaron in vitro los valores de IC50 de los compuestos glutamina (3), crisina (14), ligularósido C (15), catequina (16), quercetina-3-O-glucósido (17), kaempferol-3-O-glucósido (19) y crisin-7-O-(6”-acetil)-glucósido (28), para cada una de las enzimas estudiadas. De esta forma, se estableció que los compuestos con valores de IC50 inferiores o levemente superiores a los presentados por el control positivo acarbosa, que para α-amilasa pancreática porcina fue de 234μM, fueron los compuestos ligularósido C (409.80μM), quercetina-3-O-glucósido (31.04 μM) y kaempferol-3-O-glucósido (33.45 μM), indicando que presentan una potencia mayor o cercana a la del control positivo. Respecto a la inhibición de la α-glucosidasa presente en el extracto de intestino de rata, el compuesto quercetina-3-O-glucósido presentó un valor de IC50 de 15.37μM, que es inferior al presentado por el control positivo acarbosa (156.6μM). Todo este estudio mostró que las variaciones en la actividad inhibitoria sobre glucosil-hidrolasas por parte de los extractos polars de hojas Passiflora ligularis Juss se pueden explicar por cambios en la concentración y/o expresión de compuestos polifenólicos y saponinas, aspecto confirmado mediante estudios in silico e in vitro.Abstract: Species of Passiflora genus have been investigated under pharmacological research, due to reports of their use in the traditional treatment of several diseases, such as diabetes. Passiflora ligularis Juss or “Granadilla” is widely cultivated in the national territory, its fruit has shown bioactivity in certain pharmacological models of diabetes. On the other hand, in its leaves have been identified compounds with inhibitory activity against glucosyl-hydrolases, which are enzymes essential for carbohydrates digestion and pharmacological targets for the treatment of diabetes. According to this evidence, in this master thesis, it was studied the metabolic profile of polar extracts obtained from P. ligularis leaves. It was also identified by means of a metabolomic study the metabolites responsible for the inhibitory activity against enzymes involved in carbohydrates digestion. Subsequently, the validity of the results was sought by in vitro assays and in silico studies. Thus, and as a result of the metabolic profiling by NMR1H and HPLC-MS, 29 compounds were identified, 5 of which corresponded to amino acids, 2 to carbohydrates, 4 to organic acids, 5 to miscellaneous compounds, 1 saponin and 14 polyphenolic compounds, between them, Oglycosidic flavonoids derived from quercetin and chrysin are the most abundant. Leaves from 8 crops located in the municipalities of Anolaima, Algeciras, and Junín were studied; Those were stored under refrigeration or at room temperature. The extracts obtained from 25mg of leaves were assayed on the inhibition model of the α-glucosidase present in rat intestine extract and porcine pancreatic α-amylase, obtaining inhibition in percentages between 5-50% and between 5 -95%, respectively. The NMR1H metabolomic study allowed to establish that the storage condition is the variable with higher impact in the changes observed in metabolic profiles among the extracts specifically changes related to carbohydrates composition. Otherwise, there was no effect of the crop location and age in the differentiation among the metabolic profiles. The OPLS-DA analyses revealed that changes in the biological activity could be explained by variation in saponin-type, polyphenol-type, and aminoacid-type compounds. In silico studies, molecular docking type, among the compounds identified as possibly responsible for the changes in the bioactivity, and the rigid structures of the enzymes pancreatic porcine α-amylase and the N-terminal subunit of the human α-glucosidase, allowed to identify that the compounds: ligularoside C (15), quercetin-3-O-glucoside (17), luteolin-7- O-glucoside (17a), kaempferol-3-O-glucoside (19) and apigenin-7-O-glucoside, are the ones which would better interact with the active site of the α-amylase to inhibit it. In the case of αglucosidase, the compounds quercetin-3-O-(6”-malonyl)-glucoside (18), apigenin-7-Oglucoside (19a), kaempferol-3-O-(6”-malonyl)-glucoside (21) an isorhamnetin-3-O-(6”- malonyl)-glucoside (22) were the ones with better scores. On the other hand, for each studied enzyme the IC50 values of the compounds glutamine (3), chrysin (14), ligularoside C (15), catechin (16), quercetin-3-O-glucoside (17), kaempferol-3- O-glucoside (19) and chrysin-7-O-(6”-acetyl)-glucoside were determined. Thus, it was established that the compounds with lower or slightly higher IC50 values than the determined for the positive control acarbose, which was 234µM for the pancreatic porcine α-amylase, were the compounds ligularoside C (490.80µM), quercetin-3-O-glucoside (31.04 µM) and kaempferol-3-O-glucoside (33.45 μM), indicating that they are more or almost equal potent than the positive control. Regarding the inhibition of the α-glucosidase present in the rat intestine extract, the compound quercetin-3-O-glucoside showed an IC50 value of 15.37µM, which is lower than the one showed by acarbose (156.6µM). The whole study showed that variations in the glucosyl-hydrolases inhibitory activity of the polar extracts of leaves of Passiflora ligularis Juss can be explaining by changes in concentration and or expression of polyphenolic compounds and saponins. This fact was confirmed by in silico and in vitro studies.Maestrí