Evaluación del perfil de compuestos volátiles de guanábana (Annona Muricata L.) para el desarrollo de bases aromáticas con aplicación en la industria de alimentos

Los frutos de la familia de las anonáceas, como la guanábana (Anonna muricata L.), se encuentran dentro de los más apreciados en el mercado colombiano gracias a sus características organolépticas, en particular a su aroma y sabor característicos. El conocimiento de los compuestos del aroma relacionados con el sabor de estas frutas es crítico para el desarrollo de aditivos aromatizantes/saborizantes inspirados en ellas. Dado que las frutas de las anonáceas son climatéricas, su composición química, incluidos los perfiles de compuestos del aroma, experimentan cambios importantes durante la poscosecha, lo cual hace que sea más complejo el desarrollo de estos aditivos saborizantes. El objetivo del presente proyecto consistió en el diseño y obtención de bases aromáticas para ser usadas en la formulación de aditivos aromatizantes/saborizantes, clasificables dentro de la categoría “idénticos al natural” de guanábana, para su uso en la industria alimentaria, en particular en la producción de bebidas lácteas saborizadas. Para ello, en primer lugar se estudió el proceso de maduración de la fruta de guanábana en poscosecha. Se utilizaron frutas de guanábana provenientes de un huerto establecido en la zona de Pandi, Cundinamarca. Los frutos fueron cosechados en igual grado de madurez, correspondiente a 16 semanas luego de la formación del fruto primordial o “erizo” (cuando estas se encuentran cerca del estado semimaduro), y fueron transportadas en contenedores aislantes refrigerados a los laboratorios de Givaudan Colombia S.A.S, en Bogotá. Los frutos fueron dejados madurar en condiciones controladas (24 °C y 63% de HR), haciendo seguimiento de la maduración por medio de variables fisicoquímicas (sólidos solubles, pH y acidez). De esta manera se encontró que el estado semimaduro se alcanza al día 4 de poscosecha, el estado maduro al día 6 y el estado sobre-maduro al día 10. Posteriormente, muestras de pulpa en diferentes estados de madurez (semimaduro, maduro y sobre-madurado) se sometieron a una extracción con solvente (diclorometano) solido-líquido. Los extractos fueron analizados mediante cromatografía de gases acoplada a detección de índice de llama y espectrometría de masas (GC-FID-MS) para la determinación de los compuestos relacionados con el aroma presentes en las pulpas y sus correspondientes valores de actividad de aroma (OAV). Se encontró que en la pulpa en el estado semimaduro los compuestos predominantes fueron terpenos (45%), en particular limoneno (OAV 118) y β-cariofileno (OAV 10); alcoholes (27%), en particular cis-3-hexen-1-ol (OAV 5); y en menor medida ésteres (18%) como metil-2-trans hexenoato (OAV 1.2), y aldehídos (9%) como trans-2-hexenal (OAV 10). En la pulpa en estado maduro se encontró una mayor variedad y concentración total de compuestos relacionados con el aroma, siendo los compuestos predominantes en este caso ésteres (32%), de los cuales el más importante fue el metil hexanoato (OAV 1570); terpenos (39%), como el limoneno (OAV 1224); y alcoholes (12%), como el etil 2-hexanol (OAV 3). En la pulpa en estado sobre-madurado se encontró una disminución importante de la concentración relativa de terpenos (12%), y aunque el limoneno (OAV 23) siguió siendo el principal terpeno, se evidenció también una importante concentración de linalool (OAV 44); en esta muestra los ésteres fueron los compuestos mayoritarios (49%), con metil hexanoato (OAV 270) siendo el éster más importante, seguidos por alcoholes (19%) como etanol y hexanol, ácidos como hexanoico (OAV 1.1) y butírico (OAV 0.09), y lactonas (4%) como hexalactona gamma (OAV 0.2). Estas tres últimas clases funcionales no solamente tienen un importante impacto en el perfil de aroma/sabor, sino que sugieren que cerca de ese estado de madurez se dio el inicio de la degradación fermentativa en la fruta. Por otra parte, en Colombia, una de las maneras de consumo más habituales de frutas como la guanábana es en la forma de bebidas azucaradas, cuyos procesos de preparación pueden implicar cambios notables respecto el perfil aromático original de las frutas. Teniendo en cuenta lo anterior, la pulpa del estado maduro fue sometida a procesos estándar para la obtención de un néctar de fruta, del cual se tomó muestra para hacer una extracción con solvente (diclorometano) liquido-líquido, realizar una análisis por GC-FID-MS del extracto obtenido y de esta forma determinar los compuestos del aroma presentes en el néctar. En comparación con la muestra de pulpa madura, en el néctar se detectaron compuestos como el ácido butírico (OAV 9) y delta-hexalactona (OAV 2); los ésteres aumentaron su concentración relativa (de 32% a 43%), al igual que lactonas y cetonas, mientras que la de terpenos (28%) y alcoholes (0%) disminuyó, posiblemente por pérdidas por volatilización relacionadas con el tratamiento térmico de la pulpa en la obtención del néctar y a reacciones de esterificación, en el caso de los acoholes. De este modo se obtuvieron los perfiles de compuestos de las pulpas en varios estados de madurez y luego de procesamiento, los cuales se emplearon para la formulación de cuatro bases aromáticas para la preparación de aditivos saborizantes: (i) guanábana semimadura, (ii) guanábana madura, (iii) guanábana sobre-madurada, y (iv) néctar de guanábana. Las bases se prepararon disolviendo cantidades apropiadas de cada compuesto identificado en una mezcla insípida de triglicéridos de cadena molecular media (Miglyol®). Se realizó un análisis de perfil sensorial comparativo, por parte de un panel de 5 saboristas de Givaudan Colombia S.A.S (considerando 14 descriptores de sabor relevantes para frutas), de las bases aromáticas y de sus correspondientes dianas naturales (pulpas de guanábana semimadura, madura y sobre-madurada, y néctar de guanábana). Este análisis permitió ajustar las formulaciones aromatizantes para acercar los perfiles de sabor de los aditivos a los de sus respectivas contrapartes naturales mediante la regulación de la concentración relativa de compuestos relacionados con los descriptores que se encontraron sobre-expresados. En particular, el limoneno se redujo en un 90% en todas las formulaciones aromatizantes para reducir las notas aromáticas ‘verdes’ (green) y se eliminó el nonanal de la formulación ii (guanábana madura) para reducir su nota de ’sidra’ (cider). Un análisis comparativo del perfil sensorial posterior, utilizando las bases reformuladas, permitió confirmar un mejor ajuste de estos aditivos a sus correspondientes objetivos. Finalmente, las cuatro bases aromáticas se incluyeron como saborizantes, al 0.08%, en una bebida láctea fermentada (yogur entero endulzado). Estas bebidas fueron sometidas a evaluación sensorial por parte del panel entrenado de Givaudan Colombia S.A.S., para un análisis descriptivo del sabor, y por parte de potenciales consumidores, para una prueba de aceptabilidad. La prueba descriptiva mostró que los perfiles de sabor de los yogures saborizados determinados por el panel se asociaron con el perfil sensorial de los frutos en su respectiva etapa de maduración. Por ejemplo, el yogur con sabor a guanábana semimadura se percibió como más 'astringente' y 'más verde' [mayor intensidad de los descriptores 'verde' (green), 'verde fresco' (green fresh) y 'verde afrutado' (green fruity)]; también, la intensidad percibida del descriptor ‘dulce’ (sweet) fue más alta para el yogur con sabor a guanábana sobre-madurada y más baja para el yogur con sabor a guanábana semimadura, no obstante todas las bebidas tuviesen el mismo nivel de edulcoración (11% p/p de sacarosa). Por otro lado, la prueba de consumidores mostró un mejor desempeño del saborizante inspirado en la guanábana sobremadurada, en términos tanto de la aceptación general del yogur saborizado, como de su aproximación a la expectativa frente al sabor a guanábana. Esto sugiere que los consumidores favorecen -las características de sabor dulce y notas cremosas propias de la pulpa sobre-madurada, pese a la presencia de compuestos que convencionalmente indican pérdida de calidad organoléptica. Los resultados de esta investigación contribuyen a la actividad de investigación y desarrollo de Givaudan Colombia S.A.S y aportan a la generación de conocimiento de los compuestos aromáticos que intervienen en las propiedades sensoriales de las frutas tropicales autóctonas, así como a la aplicación comercial de dicho conocimiento.Abstract: The fruits of the Annonaceae family, such as soursop (Anonna muricata L.), are amongst the most appreciated fruits in the Colombian market due to their organoleptic properties, in particular their characteristic aroma and flavor. Knowledge on the aroma compounds related to flavor perception of these fruits is critical for the development of the aromatic / flavoring substances inspired by these. Since Annonaceae fruits are climacteric, their chemical composition, including the aroma compound profiles, undergo important changes during post-harvest, which makes the development of these flavoring additives more complex. The objective of this project was to design and obtain flavoring additives classifiable as “nature-identical” for its use in the food industry, particularly for the production of flavored milk drinks. For this, first of all the process of maturation of the soursop fruit in postharvest was studied. Soursop fruits were obtained from an orchard established in the area of Pandi, Cundinamarca (Colombia) [4°11′N 74°29′W; 1024 m.a.s.l.]. The fruits were collected in the same degree of ripeness, around 16 weeks after the “hedgehog” formation (when the fruits are near their semi-ripe state), and were transported in refrigerated and isolated containers to the Givaudan Colombia S.A.S facilites in Bogota. The fruits were left to ripe under controlled conditions (24°C and 63% RH) and a follow-up was made through physicochemical variables (soluble solids, pH and acidity). In this way, it was found that the semi-ripe state is reached on day 4 of post-harvest, the ripe state on day 6 and the overripe state on day 10. Subsequently, the pulp samples at three different ripeness degrees (semi-ripe, ripe and over-ripen) were extracted with dichloromethane. The extracts were analyzed by gas chromatography coupled with flame index detection and mass spectrometry (GC-FID-MS) for the determination of the compounds related to the aroma present in the pulps and their corresponding values of odor activity (OAV). The chromatographic analysis indicated that in the semi-ripe pulp the predominant compounds were terpenes (45%), in particular limonene (OAV 118) and β-caryophyllene (OAV 10); alcohols (27%), in particular cis-3- hexen-1-ol (OAV 5); and to a lesser extent esters (18%) such as methyl-2-transhexenoate (OAV 1.2), and aldehydes (9%) such as trans-2-hexenal (OAV 10). In the ripe pulp, a greater variety and total concentration of aroma-related compounds was found, with predominance of esters (32%), of which the most important was methyl hexanoate (OAV 1570); terpenes (39%), such as limonene (OAV 1224); and alcohols (12%), such as ethyl 2-hexanol (OAV 3). In the overripe pulp, a significant decrease of the relative concentration of terpenes was found (12%), and although limonene (OAV 23) remained the main terpene, an important concentration of linalool was also evident (OAV 44); in this pulp esters were the major compounds (49%), with methyl hexanoate (OAV 270) being the most important one, followed by alcohols (19%) such as ethanol and hexanol; acids such as hexanoic (OAV 1.1) and butyric (OAV 0.09); and lactones (4%) such as gamma hexalactone (OAV 0.2). These last three functional classes not only have an important impact on the flavor profile, but also suggest that the beginning of the fermentative degradation in the fruit occurred near that ripeness stage. On the other hand, in Colombia, one of the most common ways of consuming fruits such as soursop is in the form of sugary drinks, whose preparation processes can induce significant changes with respect to the original aromatic profile of the fruits. Therefore, ripe pulp was subjected to standard processes for obtaining a fruit drink (nectar). Dichloromethane extracts from the nectar were obtained, by liquid-liquid extraction, and analyzed by GC-FID-MS, in order to evaluate the profile of aroma compounds present in the drink. In comparison with the raw ripe pulp, compounds such as butyric acid (OAV 9) and delta-hexalactone (OAV 2) were detected in the nectar; the esters increased their relative concentration (from 32% to 43%), as did lactones and ketones, whereas that of terpenes (28%) and alcohols (0%) decreased, possibly due to volatilization losses during the heat treatment of pulp in the nectar processing. In this way, the profiles of aroma-related compounds of the pulps were obtained in various stages of ripeness and after pulp processing, which were used for the formulation of four aromatic bases for the preparation of flavoring additives: (i) semi-ripe soursop, (ii) ripe soursop, (iii) overripe soursop, and (iv) soursop nectar. The bases were prepared by dissolving appropriate amounts of each identified compound in an insipid mixture of medium molecular chain triglycerides (Miglyol®). A comparative sensory profile analysis (considering 14 fruit flavor descriptors) of both the flavorings agents and their corresponding natural targets (semi-ripe, ripe and overripe soursop pulps, and soursop nectar) was performed by a panel of 5 flavorists of Givaudan Colombia S.A.S. This analysis allowed to adjust the flavorings formulations to bring the flavor profiles of the additives closer to those of their natural targets by regulating the relative concentration of compounds related to over-expressed descriptors. Namely, limonene was 90%-reduced in all the flavorings formulations to reduce “green” notes, and nonanal was eliminated from the ripe soursop-flavoring formulations to reduce its “cider” note. A comparative sensory profile analysis using the reformulated flavoring agents allowed to confirm a better adjustment of the additives to their targets. The three adjusted nature-identical flavorings were tested in concentrations of 0.08% in sweetened whole yogurts. The flavored yogurts were subjected to a descriptive sensory test by 9 trained panelists (considering the same 14 flavor descriptors) and to a consumer acceptance test by 40 frequent consumers of yogurt. The descriptive test showed the perceived sensory profiles of the flavored yogurts were associated with the sensory profile of the fruits at their respective ripening stage. For instance, yogurt flavored with the additive inspired in semi-ripe soursop was perceived as ‘greener’ (higher intensity of the descriptors ‘green’, ‘green fresh’ and ‘green fruity’) and more ‘astringent’; also, the perceived intensity of the descriptor ‘sweet’ was the highest for the overripe soursopflavored yogurt and the lowest for the semi-ripe soursop-flavored yogurt. Finally, the consumer acceptance test showed a better performance of the nature-identical flavoring agent inspired in overripe soursop in terms of both the overall acceptance of the flavored yogurt and its approximation to a naturally flavored drink. The results of this research contribute to the R and D activity of Givaudan Colombia S.A.S, to the generation of knowledge about aromatic compounds that define the sensory properties of native tropical fruits, as well as to the commercial use and application of this knowledge.Maestrí