Establishment of X-chromosome inactivation pattern analysis of polymorphic microsatellites of the androgen receptor gene for clonality detection of various canine and feline tumours from archived material

Die meisten Tumoren haben einen monoklonalen Ursprung. Zur Nutzung dieser Eigenschaft von Tumoren für die Diagnostik wurden in der Veterinärmedizin bereits zahlreiche Techniken entwickelt. Bis heute gibt es jedoch keinen für die Routinediagnostik einsetzbaren Klonalitätstest für nicht lymphoide Tumoren. Eine Methode zur Analyse der Klonalität von Tumoren besteht in der Untersuchung des Inaktivierungsmusters von X-chromosomalen Genloki weiblicher Individuen. Die theoretische Grundlage für die X-Chromosom-Inaktivierungsmuster-Analyse bildet die Lyon-Hypothese, welche besagt, dass in normalen somatischen Zellen eines weiblichen Individuums immer eines der beiden X-Chromosomen inaktiviert vorliegt. Die Inaktivierung erfolgt zu einem sehr frühen embryonalen Zeitpunkt. In jeder embryonalen Zelle wird nach dem Zufallsprinzip bestimmt, ob das väterliche oder das mütterliche X-Chromosom inaktiviert wird. Diese Inaktivierung wird dann stabil auf alle Tochterzellen weitergegeben. Damit besteht jedes weibliche ausdifferenzierte Gewebe aus einem Mosaik von Zellen, in denen jeweils unterschiedliche X-Chromosomen inaktiviert vorliegen. Bei einem monoklonalen Tumor hingegen liegt in jeder Zelle das gleiche X-Chromosom inaktiviert vor. Diese klonale Inaktivierung gilt es in der X-Chromsom-Inaktivierungsmuster-Analyse an ausgewählten Genloki nachzuweisen. Eine unverzichtbare Voraussetzung dafür ist die Heterozygotie der Allele für einen leicht zu findenden Polymorphismus. Bei der vorliegenden Arbeit handelt es sich um eine kumulative Dissertation, die auf zwei Publikationen beruht. Beide Texte wurden in englischsprachigen, internationalen Fachzeitschriften mit Gutachtersystem publiziert und beschreiben die Etablierung zweier X-Chromosom-Inaktivierungsmuster-Analysen für die Anwendung bei kaninen und felinen Tumoren aus Formalin-fixiertem und Paraffin-eingebettetem Material. Als Zielsequenzen für die X-Chromosom-Inaktivierungsmuster-Analysen wurden polymorphe Mikrosatelliten des Androgenrezeptor-Gens gewählt. Zur Gewinnung erster Anhaltspunkte bzgl. der generellen Funktionalität der entwickelten Assays wurden diese an verschiedenen kaninen und felinen archivierten Proliferationen getestet. Der für den Hund entwickelte Assay wurde schwerpunktmäßig an kutanen Histiozytomen (n = 11) und zudem an Mammaadenomen (n = 11), einem Mammakarzinom (n = 1), Glioblastomen (n = 2) sowie glandulären Hyperplasien (n = 3) gestestet. Der für die Katze entwickelte Assay wurde an Lymphomen (n = 9) und lymphatischen Hyperplasien (n = 2) geprüft. Sowohl das kanine als auch das feline Androgenrezeptor-Gen erwiesen sich als geeignete Genloki für diese Art von Klonalitätsanalyse. Durch die Anwendung der X-Chromosom-Inaktivierungsmuster-Analyse auf polymorphe Regionen des Androgenrezeptor-Gens oben genannter Tumoren konnten bei allen Tumoren, mit Ausnahme eines Lymphoms, nicht zufällige monoklonale Inaktivierungsmuster detektiert werden und insbesondere bei den kaninen kutanen Histiozytomen und den felinen Lymphomen nach ausführlicher Interpretation der Ergebnisse Rückschlüsse auf die Monoklonalität dieser Tumoren gezogen werden. Nur bei einem felinen Lymphom stellte sich ein sehr wahrscheinlich artifizielles, falsch polyklonales Inaktivierungsmuster dar. Alle in der Arbeit untersuchten glandulären und lymphatischen Hyperplasien erwiesen sich im Gegensatz zu den Tumoren als polyklonal. Damit konnte in der vorliegenden Arbeit die grundsätzliche Funktionalität der Assays an den untersuchten archivierten Tumoren dargestellt werden. Diese Arbeit beschreibt den ersten Schritt der Testentwicklung. In einem nächsten Schritt müssen die entwickelten X-Chromosom-Inaktivierungsmuster-Analysen einer systematischen Qualitätsprüfung hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität unterzogen werden. Diese Quallitätsprüfung war jedoch nicht das Ziel der vorliegenden deskriptiven Arbeit, sondern muss in einer Folgearbeit an deutlich höheren Fallzahlen durchgeführt werden. In der vorliegenden Arbeit stellten niedrige Fallzahlen heterozygoter Individuen eine technische Limitierung für eine derartige Prüfung dar. Bei Hunden und Katzen ist die Heterozygotie-Rate am Androgenrezeptor-Genlokus im Vergleich zum Menschen allgemein niedriger. Dies wirkt sich nachteilig auf die Anwendbarkeit kaniner und feliner Gewebe in der X-Chromosom-Inaktivierungsmuster-Analyse aus. In der vorliegenden Arbeit wurde eine besonders niedrige Heterozygotie-Rate bei Hunden (19 %) und bei Katzen (37,5%) festgestellt. Ein Zusammenhang mit dem Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Probenmaterial wird vermutet. Zur Verbesserung der Anwendbarkeit sollten zukünftig erweiterte Assays entwickelt werden, die mehr als einen polymorphen Genlokus untersuchen und damit eine höhere Heterozygotie-Rate ermöglichen. Insgesamt gesehen, können die in dieser Arbeit entwickelten Klonalitätsassays für einen erfahrenen Diagnostiker gute Werkzeuge zur Ergänzung der routinemäßigen Tumordiagnostik bei unklaren Befunden sein. Die Methode sollte zukünftig allerdings durch weitere Zielsequenzen in ihrer Anwendbarkeit verbessert sowie einer Qualitätsprüfung unterzogen werden. Grundsätzlich ist sie bei vielen Formen von Neoplasien weiblicher Tiere anwendbar. Jedes Ergebnis muss jedoch in Bezug auf spezielle Tumoreigenschaften (insbesondere im Hinblick auf Tumorheterogenität) und Interpretationsfehler evaluiert und im Gesamtzusammenhang mit anderen diagnostischen Parametern ausgewertet werden.Most tumours have a monoclonal origin. Numerous techniques have already been developed in veterinary medicine to exploit this characteristic of tumours for diagnostic purposes. To date, however, there is no clonality test for non-lymphoid tumours that can be used for routine diagnostics. One method to analyse the clonality of tumours consists in the investigation of the inactivation pattern of X-linked gene loci of female individuals. The theoretical basis for the X-chromosome inactivation pattern analysis is the Lyon hypothesis, which states that in normal somatic cells of a female individual there is always one of the two X-chromosomes inactivated. The inactivation occurs at a very early embryonic stage. In each embryonic cell it is determined at random whether the paternal or maternal X-chromosome is inactivated. This inactivation is then passed on stably to all daughter cells. Thus, every female differentiated tissue consists of a mosaic of cells in which different X-chromosomes are inactivated. In a monoclonal tumour, on the other hand, the same X-chromosome is present in inactivated form in every cell. This clonal inactivation has to be detected in the X-chromosome inactivation pattern analysis on selected gene loci. An indispensable prerequisite for this is the heterozygosity of the alleles for an easily found polymorphism. The present work is a cumulative dissertation based on two publications. Both papers have been published in international peer-reviewed journals and describe the establishment of two X-chromosome inactivation pattern analyses for application to canine and feline tumors of formalin-fixed and paraffin-embedded material. Polymorphic microsatellites of the androgen receptor gene were chosen as target sequences for the X-chromosome inactivation pattern analyses. In order to gain first clues regarding the general functionality of the developed assays, they were tested on different canine and feline archived proliferations. The assay developed for the dog was mainly tested on cutaneous histiocytomas (n = 11) and also on mammary adenomas (n = 11), a mammary carcinoma (n = 1), glioblastomas (n = 2) and glandular hyperplasias (n = 3). The assay developed for cats was tested on lymphomas (n = 9) and lymphatic hyperplasias (n = 2). Both the canine and the feline androgen receptor gene were found to be suitable gene loci for this type of clonality analysis. By applying the X-chromosome inactivation pattern analysis to polymorphic regions of the androgen receptor gene of the above-mentioned tumors, non-random monoclonal inactivation patterns could be detected in all tumors except one lymphoma. Especially in canine cutaneous histiocytomas and feline lymphomas, conclusions on the monoclonality of these tumors could be drawn after detailed interpretation of the results. Only in the case of one feline lymphoma there was an artificial, false-polyklonal inactivation pattern very likely. All glandular and lymphatic hyperplasias investigated in the study were polyclonal in contrast to the tumors. Thus, the present study was able to demonstrate the basic functionality of the assays on the investigated archived tumors. This thesis describes the first step of the test development. In the next step, the developed X-chromosome inactivation pattern analyses should be subjected to a systematic quality check with regard to their sensitivity and specificity. However, this quality test was not the aim of the present descriptive work, but has to be carried out in a follow-up work on significantly higher numbers of cases. In the present study, low case numbers of heterozygous individuals represented a technical limitation for such a test. In dogs and cats the heterozygous rate at the androgen receptor gene locus is generally lower compared to humans. This adversely affects the applicability of canine and feline tissues in X-chromosome inactivation pattern analysis. In the present study a particularly low heterozygosity rate was found in dogs (19%) and in cats (37.5%). An association with formalin-fixed paraffin-embedded sample material is suspected. To improve the applicability, extended assays should be developed in the future, which examine more than one polymorphic gene locus and thus enable a higher heterozygosity rate. All in all, the clonality assays developed in this work can be good tools for an experienced diagnostician to supplement routine tumor diagnostics in case of unclear findings. In the future, however, the method should be improved in its applicability through the addition of further target sequences and be subject to quality control. In principle, it can be used for many forms of neoplasia of female animals. However, each result must be evaluated with regard to specific tumour characteristics (especially with regard to tumour heterogeneity) and interpretation errors and evaluated in the overall context of other diagnostic parameters