Análises dos mecanismos imunopatológicos e moleculares envolvidos no processo de citoaderência de Plasmodium vivax

Orientadores: Fabio Trindade Maranhão Costa, Letusa AlbrechtTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Plasmodium vivax é o parasita causador malária humana mais prevalente, disseminado e negligenciado, colocando todos os anos bilhões de pessoas em risco de infeção, acarretando sérios problemas de saúde e econômicos. A emergência de resistência a antimaláricos e complicações clínicas graves são preocupantes. Pouco se sabe sobre os mecanismos envolvidos nas características patogénicas da biologia do negligenciado P. vivax. A impossibilidade de executar a cultura in vitro de isolados a longo prazo, limita os pesquisadores ao estudo da sua biologia no espaço e tempo, restringindo o trabalho experimental a áreas endêmicas de malária vivax, onde a execução bem-sucedida de aplicações ômicas é desafiadora. A capacidade de P. vivax remodelar a membrana dos reticulócitos do hospedeiro e promover a sua adesividade foi já demostrada, dendo um mecanismo importante de evasão ao sistema imunitário humano. Estudos funcionais têm reportado que a adesão de reticulócitos infectados por P. vivax (RTi-Pv) a células endoteliais do hospedeiro, apesar de em menor número, é forte e estável, como o verificado para eritrócitos infectados por P. falciparum. Também foi observado que a adesão de eritrócitos não infectados a RTi-Pv é forte e resulta na formação estável de rosetas, que apresenta uma maior taxa em malária vivax do que falciparum. Mais recentemente, foi publicado que existe uma correlação entre a formação de rosetas e a deformabilidade de RTi-Pv, na qual RTi-Pv que formam rosetas são significativamente mais rígidos. Estágios maduros de P. vivax (esquizontes) têm elevada capacidade de aderir relativa a outros estágios assexuais do parasita, em ambos fenótipos de citoadesão e roseteamento. A menor proporção de esquizontes na circulação sanguínea periférica de pacientes sugere que os parasitas podem sequestrar no endotélio vascular do hospedeiro. Os RTi-Pv que formam rosetas poderão ser a causa desta baixa taxa de esquizontes circulantes no sangue dos pacientes, contribuindo para o fenómeno de sequestro parasitário na microvasculatura e/ou baço do hospedeiro, e consequentemente contribuindo para características reopatológicas da malária vivax. Autópsias de pacientes com malária vivax mostraram a acumulação de RTi-Pv nos pulmões, baço, fígado e medula óssea. Ainda, foi demonstrado que a parasitemia subestima a biomassa total parasitária, que é elevada em malária vivax severa, portanto, capaz de mediar a inflamação sistémica da patologia. O objetivo deste estudo é a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos nos fenótipos adesivos, identificando proteínas, principalmente ligantes parasitários, que possam ser importantes na capacidade de aderência de P. vivax. Usando RNA-seq em conjunto com o enriquecimento, maturação ex vivo e ensaio funcional de adesão com amostras clínicas de P. vivax, foi sequenciado o transcriptoma de populações de parasitas com características adesivas distintas. Os nossos perfis de expressão mostram a importância de diferentes grupos de proteínas membranares ou associadas a membranas, com propriedades de adesinas, tais como proteínas Plasmodium Interspersed repeats (PIR) e Plasmodium Helical Interspersed SubTelomeric (PHIST), que podem ter um papel importante no fenótipo adesivo de P. vivax. Dentro deste grupo de proteínas diferencialmente expressas foi verificado que muitas são tradicionalmente produzidas por parasitas em fase sexuada, sugerindo a importância da formação de rosetas por gametócitos de P. vivax. Adicionalmente, análise do perfil de expressão gênica humano permitiu a identificação de genes diferencialmente expressos associados a vias de fagocitose. Estes dados sugerem fortemente que o fenótipo de roseteamento pode impedir a fagocitose do parasita por leucócitos como resposta do sistema imune humano à infeção. Os resultados obtidos refletem as características patogénicas de populações brasileiras circulantes de P. vivax, principalmente no que diz respeito à sua capacidade de aderência como principal fonte das manifestações clínicas severas reportadas. Para além disso, esperamos que estes dados abram ainda mais as investigações sobre a biologia deste parasita apicomplexo, ajudando no desenho de vacinas e na descoberta de novos antimaláricos, promovendo o sucesso na eliminação da malária vivax no futuro.Abstract: Plasmodium vivax is the most prevalent, widespread and neglected human malaria parasite, currently placing billions of people at risk of infection, thus imposing major health and economic burdens. Worldwide, anti-malarial drug resistance emergence and severe clinical complications are of great concern. The mechanisms underlying the pathobiology of the neglected P. vivax are still little known. The lack of a reliable in vitro P. vivax long-term culture restricts its biology study in place and time, relegating researchers to work in malaria endemic field conditions, where successful omics applications are very challenging. The capacity of P. vivax to remodel host reticulocyte membrane and promote adhesivity has been demonstrated, which is an important mechanism for host immune evasion. Functional studies have already reported that adhesion of P. vivax infected red blood cells (PvIRBCs) to the host endothelial cells, although in considerably lower rates, is as strong and stable as the verified for P. falciparum infections. Also, it has been reported adhesion of normocytes to the PvIRBCs is strong and results in stable rosette formation, which shows higher rates in vivax compared to falciparum malaria. More recently, it was reported that there is a correlation between rosette formation and altered membrane deformability of PvIRBCs, where the rosette-forming PvIRBCs are significantly more stiff and rigid than their non-rosetting equals. Mature staged parasites (schizonts) show a higher capacity for adherence than other asexual parasite stages both in cytoadherence and rosetting. The lower proportion of schizonts observed on the peripheral blood circulation of patients suggests that parasites could be sequestered on the host vascular endothelium. Rosette-forming PvIRBCs may also be the cause for this lower rate of schizonts in the patients’ blood, contributing for parasite sequestration phenomena in the host microvasculature and/or spleen, and consequently, the rheopathological characteristics present in vivax malaria disease. Vivax malaria patient autopsies have shown accumulation of PvIRBCs in the lungs, spleen, liver and bone marrow. Additionally, it has been demonstrated that parasitemia underestimates total parasite biomass, which is greater in severe vivax malaria patients, and thus, capable of mediating systemic inflammatory pathology. In this study, we aimed to understand the molecular mechanisms behind adherence phenotypes by identifying proteins, especially parasitic ligands, which might be important in P. vivax adhesion capacity. Using RNA-seq coupled with parasite field sample enrichment, ex vivo maturation and cytoadherence assays, we have sequenced the whole transcriptome of parasite populations with distinct adhesive characteristics. Our expression profiles brings out the importance of membrane and membrane-associated proteins, with adhesin or adhesin-like properties, such as Plasmodium Interspersed repeats (PIR) and Plasmodium Helical Interspersed SubTelomeric (PHIST) proteins, which might pay a role in adherence phenotypes. Within those protein groups, we found a percentage of differentially expressed genes that traditionally are more expressed in sexual rather than asexual parasite stages, suggesting the relevance of rosette formation by P. vivax gametocytes. Importantly, we found host immune-related differentially expressed genes, of which several are associated with the human phagocytosis pathways. These data strongly suggest that rosetting can hamper leukocyte phagocytosis host immune response, as an effective mechanism of P. vivax immune evasion adaptation. Our results reflect the pathobiology of circulating Brazilian P. vivax populations, principally concerning its adhesive capacity as a possible source of the severe clinical manifestations reported. Furthermore, we hope that such achievements will further enable the investigations on the biology of P. vivax apicomplexan parasite, impacting considerably in vaccine and drug design, ultimately helping us achieve the future elimination of vivax malaria.DoutoradoImunologiaDoutora em Genética e Biologia Molecular2013/20509-5FAPES