T lymphocyte engineering for the recognition of acute lymphoid leukemia

Orientador: Pedro Otavio de Campos LimaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Introdução: A leucemia linfóide aguda (LLA) é o câncer mais comum em crianças, representando 31% de todos os tumores. O tratamento convencional em crianças com LLA baseia-se em regimes quimioterapêuticos que vêm apresentando bons resultados com taxas de cura em torno de 80 a 90%. Apesar disto, 10-20% das crianças apresentam falha da resposta à terapia de primeira linha, bem como a ocorrência de recidiva da doença. A imunoterapia com linfócitos T geneticamente modificados tem mostrado resultados promissores para o tratamento das recidivas. Nesta abordagem, um receptor quimérico (CAR) é expresso nos linfócitos T para reprogramar sua especificidade. Todavia, existem alguns aspectos limitantes para incorporá-la à conduta terapêutica regular, como: a grande quantidade de cada vetor a ser produzida, o número elevado de células a serem transduzidas, não obstante a expansão in vivo, o custo elevado da produção/purificação de vetores e transdução de linfócitos e susceptibilidade a apoptose dos linfócitos injetados, principalmente em um microambiente tumoral. Objetivo: Diante disso, propusemos otimizar a utilização da via glicolítica dos linfócitos usados em imunoterapia (CAR anti-CD19), de forma a uniformizar e melhorar o perfil bioenergético, tornando estes linfócitos mais eficazes na resposta e vida efetora útil. Métodos: Em nossa estratégia, linfócitos T foram modificados geneticamente ex vivo com vetores lentivirais para induzir a expressão simultânea de um receptor quimérico (CAR) anti-CD19 e do transportador de glicose GLUT1. Estas células reprogramadas foram estudadas em testes de função efetora in vitro. Resultados: Obtivemos sucesso na expressão do CAR anti-CD19 na superfície dos linfócitos T, com boas taxas de transdução entre 40 e 70%. A população de linfócitos T modificada com o CAR anti-CD19-GLUT1 possui uma expressão aumentada do transgene GLUT1 na membrana, gerando uma maior internalização de glicose. Estes linfócitos também apresentaram maior utilização da via glicolítica, maior respiração basal, capacidade máxima de respiração e reserva respiratória aumentadas. Há um aumento na produção de INF-gama e uma atividade efetora citotóxica específica capaz de reconhecer e eliminar o alvo leucêmico CD19+. Observou-se também uma maior resistência a apoptose em condições limitantes de glicose e uma maior vantagem proliferativa em resposta ao estímulo com a célula-alvo Nalm-6. Conclusões: A análise global dos resultados indica que a coexpressão do transportador de glicose GLUT1 com o receptor quimérico anti-CD19, promove uma vantagem bioenergética, produzindo um perfil de atividade efetora mais eficaz e talvez torne esta imunoterapia celular mais acessível aos pacientes com leucemia. No entanto, esta abordagem deve ser testada primeiramente in vivo, antes de considerada sua relevância clínicaAbstract: Introduction: Acute lymphoid leukemia (ALL) is the most commom form of childhood cancer, representing 31% of all tumors. The conventional treatment in children with ALL is based on chemotherapeutic regimens which have been presenting good results with cure rates around 80% to 90%. Despite this, 10-20% of the children present failure of response to the first category therapy, as well as the occurence of desease relapse. The immunotherapy with genetically modified T-cells has been shown promising results to the relapse treatment. However, there are some limiting aspects to incorporate it to the regular therapeutic conduct, such as: the great amount of vector to be produced, the elevated number of cells to be transduced, notwithstanding the in vivo expansion, the elevated cost of the vectors production/purification and lymphocytes transduction and susceptibility to apoptosis of the injected lymphocytes, specially in a tumoral microenvironment. Objective: Before that, we proposed to optimize the use of the glycolytic pathway of these anti-CD19 CAR T-cells, in order to standardize and improve the bioenergetic profile, making these lymphocytes more effective in responding and effector useful life. Methods: In our strategy, T-cells were genetically modified in ex vivo with lentivirals to induce CAR anti- CD19 expression and the glucose transport Glut-1. Those reprogrammed cells were studied in effector function tests in vitro. Results: We succeeded in the CAR anti-CD19 expression in the T- cells surface, with good transduction rates between 40 and 70%. The T-cells population modified with CAR anti-CD19-GLUT1 owns an increased expression of the GLUT1 transgene in the membrane, generating a bigger internalization of the glucose. These lymphocytes also exhibited increased utilization of the glycolytic pathway, increased basal respiration, maximum respiration capacity and respiratory reserve. There was increase in INF-gama production and proved to be with a specific cytotoxic effector activity acknowledging and eliminating the leukemic target CD19+. They also showed a bigger apoptosis resistance in glucose limiting conditions and a bigger proliferative advantage in response to stimulus with the target cell Nalm-6. Conclusions: A global analysis of the results indicates that the coexpression of the glucose conveyor GLUT1 with the chimeric receptor anti-CD19, promotes a bioenergetic advantage, produzing a more efficient effector activity profile and may make this cellular immunotherapy more accessible to leukemia patients. However, this approach should be tested in vivo its clinical relevance.DoutoradoFisiologiaDoutora em Biologia Funcional e Molecular0012015/03009-4CAPESFAPES