Functional and structural characterization of sugar ABC transporters in Mycobacterium tuberculosis

Orientador: Andrea Balan FernandesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Os transportadores ABC (ATP-Binding Cassette) formam uma grande superfamília de complexos de proteínas que promovem o transporte de uma ampla gama de substratos através de membranas biológicas em eucariotos e procariotos. Estruturalmente consistem em dois domínios transmembrana hidrofóbicos (TMDs) e dois domínios citoplasmáticos de ligação ao nucleotídeo (NBDs). No caso dos importadores, uma proteína periplasmática ou domínio de ligação ao substrato (SBP) adicional é responsável pela afinidade e a especificidade do transporte. Os importadores ABC de açúcares são de grande importância na nutrição e sobrevivência de bactérias patogênicas e a identificação e caracterização destes sistemas é um passo para o conhecimento sobre a fisiologia do microrganismo. Este trabalho, teve como objetivo principal o estudo de quatro sistemas ABC relacionados ao transporte de açúcares em M. tuberculosis: LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC e UgpAEBC, por meio de análises comparativas genômicas, filogenéticas e estruturais. Os resultados evidenciaram que os transportadores ABC Rv2038c-41c e UgpAEBC são exclusivos de espécies patogênicas do gênero Mycobacterium e podem estar relacionados à infecção e patogenicidade. A comparação das SBPs, TMDs e NBDs de M. tuberculosis com ortólogos putativos e análises filogenéticas mostraram que os componentes se dividem em quatro grupos de acordo com a função dos transportadores. Análises estruturais associadas às de filogenia, revelaram que os componentes de membrana são os mais diversificados e que as principais diferenças nesses TMDs se encontram na região de interface com a proteína periplasmática. Os NBDs são os mais conservados e as SBPs divergem principalmente na região do sítio de interação com os ligantes. Estudos de modelagem e docagem molecular sugerem que LpqY seja uma proteína ligadora de trealose e Rv2041c de açúcares cíclicos. Adicionalmente, avaliamos a possibilidade de estudar as interações entre TMDs e NBDs dos transportadores ABC utilizando-se peptídeos miméticos às hélices de acoplamento. Para tal, foram usados peptídeos das hélices de acoplamento dos componentes transmembrana MalF e MalG e o componente citoplasmático MalK, do sistema de transporte de maltose MalEFGK2 de Escherichia coli. Ensaios biofísicos de fluorescência (Fluorescência Diferencial de Varredura, DSF; Termoforese em microescala, MST) e estudos de espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) mostraram que MalK se liga aos peptídeos com um Kd entre 47.8 e 20.9 µmol L-1, e que MalK sofre desestabilização térmica na presença de MgCl2 e ATP, e do peptídeo MalFch. As análises de SAXS mostraram que os dois peptídeos desencadeiam mudanças conformacionais na proteína MalK. A análise da fluorescência intrínseca do triptofano mostrou que a fluorescência dos dois únicos triptofanos em MalK não muda na presença de ambos os peptídeos. Este trabalho evidenciou o papel dos transportadores ABC de açúcares em M. tuberculosis, e a partir de uma abordagem multidisciplinar mostrou o papel destes componentes na família de transportadores ABC. O uso de peptídeos codificando as hélices de acoplamentos dos componentes transmembrana, se mostrou como uma alternativa interessante para estudos de interação proteína-proteína nestes transportadores, e essa abordagem pode servir como modelo para o estudo destas interações em outros sistemas de membrana e futuros estudos de inibição destes transportadores em bactérias patogênicasAbstract: ABC (ATP Binding Cassette) transporters form a large superfamily of protein complexes that mediate the transport of a wide range of substrates across biological membranes in eukaryotes and prokaryotes. Structurally, they consist of two hydrophobic transmembrane domains (TMDs) and two cytoplasmic nucleotide-binding domains (NBDs). In the case of importers, an additional periplasmic substrate-binding protein or domain (SBP) is responsible for the affinity and specificity of the transport. Sugar ABC importers are of great importance for the nutrition and survival of pathogenic bacteria and the identification and characterization of these systems is a step towards knowledge about the physiology of the microorganism. This work had as main objective the study of four ABC systems related to sugar transport in M. tuberculosis, LpqY/SugABC, Rv2038c-41c, UspABC and UgpAEBC, through comparative genomic, phylogenetic, and structural analyzes. The results showed that the ABC transporters Rv2038c-41c and UgpAEBC are exclusive to pathogenic species of Mycobacterium genus and may be related to infection and pathogenicity. The comparison of M. tuberculosis SBPs, TMDs and NBDs with putative orthologs and phylogenetic analyzes showed that the components are divided into four groups according to the function of the transporters. Structural analyzes associated with those of phylogeny revealed that the membrane components are the most diversified and the main differences in these TMDs are found in the interface region with the periplasmic protein. NBDs are the most conserved and SBPs differ mainly in the region of the site of interaction with the substrates. Molecular modeling and docking studies suggest that LpqY and Rv2041c are a trehalose-binding protein and a cyclic sugar-binding protein, respectively. Additionally, we evaluated the possibility of studying the interactions between TMDs and NBDs of ABC transporters, using peptides mimetizing to the coupling helices. For this purpose, peptides from the coupling helices of the transmembrane components MalF and MalG and the cytoplasmic component MalK from the MalEFGK2 maltose ABC transport system of Escherichia coli were used. Biophysical fluorescence assays (Differential Scanning Fluorescence, DSF; Microscale thermophoresis, MST), and small angle X-ray scattering (SAXS) studies showed that MalK binds to peptides with a Kd between 47.8 and 20.9 µmol L-1, and that MalK undergoes thermal destabilization in the presence of MgCl2 and ATP, and of the MalFch peptide. SAXS analyzes showed that both peptides trigger conformational changes in the MalK protein. Analysis of the intrinsic fluorescence of tryptophan showed that the fluorescence of the only two tryptophans in MalK does not change in the presence of both peptides. This work highlighted the role of sugar ABC transporters in M. tuberculosis, and from a multidisciplinary approach showed the role of these components in the ABC transporter family. The use of peptides encoding the coupling helix of the transmembrane components, proved to be an interesting alternative for studies of protein-protein interaction in these transporters, and this approach can serve as a model for the study of these interactions in other membrane systems and future transporter inhibition studies in pathogenic bacteriaDoutoradoGenética de MicroorganismosDoutora em Genética e Biologia Molecular0012018/20162-9CAPESFAPES