Development of fermentation technology for the production of butanol from sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysate : integrating cell immobilization and repeated fed-batch

Orientador: Adriano Pinto MarianoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuímicaResumo: Este projeto de doutorado propôs desenvolver uma tecnologia experimental de fermentação para a produção de butanol a partir da xilose do hidrolisado hemicelulósico de bagaço da cana-de-açúcar não-destoxificado, integrando a imobilização celular (agentes imobilizadores: bagaço de cana-de-açúcar e suporte de poliamida branca 12 produzido via impressão 3D ¿ peças 3D) com operação em batelada alimentada repetida. Na primeira parte, o problema dos inibidores microbianos foi resolvido parcialmente, a fermentação foi iniciada com melaço diluído e alimentada com hidrolisado após 24 h, assim evitou-se que os inibidores interferissem na fase de adaptação do microrganismo. Neste esquema de batelada alimentada por pulso a Clostridium saccharoperbutylacetonicum DSM 14923 foi capaz de co-fermentar xilose, sacarose, glicose e frutose em uma fermentação que continha uma proporção de melaço/hidrolisado de 3:1. O rendimento do butanol foi de 0,31 g·g-1 e sua concentração de 10,00 g·L-1 após 72 h de fermentação. Na segunda parte, avaliou-se a capacidade da linhagem de fermentar melaço diluído diretamente no hidrolisado no esquema de batelada repetida com imobilização celular. A linhagem não foi capaz de fermentar a mistura de hidrolisado e melaço em batelada simples; deste modo, no esquema de batelada repetida (a quantidade do hidrolisado aumenta no meio de fermentação em três etapas), o experimento iniciou com o agente imobilizador e usando como meio melaço diluído na primeira ou duas primeiras bateladas (etapa 1), com o propósito de fortalecer o início do crescimento do microrganismo e a imobilização celular. A batelada seguinte foi realizada no esquema de batelada alimentada por pulso, na proporção de melaço/hidrolisado de 1:3 (etapa 2, introduzindo assim o microrganismo em contato gradual com os inibidores). As bateladas seguintes foram carregadas com melaço diluído diretamente no hidrolisado e suplementado com nutrientes (etapa 3). Os resultados mostraram que utilizando o bagaço, obteve-se na sexta batelada (etapa 3) uma conversão de xilose de 44,68 % e de sacarose de 71,37 %, com rendimento de 0,19 g·g-1 e concentração de butanol de 3,90 g·L-1 após 360 h de fermentação. Além disso, usando as peças 3D, na quinta batelada (etapa 3) a conversão de xilose e sacarose foi de 37,38 e 81,39 %, respectivamente, com rendimento de 0,22 g·g-1 e concentração de butanol de 4,18 g·L-1 após 288 h de fermentação. Portanto, os resultados demonstraram que as peças 3D podem ser usadas como um agente imobilizador celular para clostrídios solventogênicos. No entanto, foi o bagaço que teve melhor desempenho do que a peça 3D nos experimentos em batelada repetida, pois a conversão de xilose média durante a etapa 3 foi de 36 %, no caso da peça 3D foi somente de 16 %. Assim, para a condição testada com bagaço se alcançou uma quantidade de butanol de segunda geração de 41 % do butanol total produzido durante 360 h, mostrando como resultado que a linhagem foi capaz de suportar o estresse do inibidor (não apenas do ácido acético, mas também dos compostos fenólicos) e a fermentação não cessou quando foi desafiada pelas condições da etapa 3.Abstract: This doctoral project proposed to develop an experimental fermentation technology for the production of n-butanol from xylose of non-detoxified sugarcane bagasse hemicellulose hydrolysates. The project integrates cell immobilization (with two options of immobilization supports: sugarcane bagasse and white polyamide 12 support produced via 3D printing ¿ 3D pieces) with repeated fed-batch operation. In the first part, the microbial inhibitors problem was partially solved. The fermentation was started with diluted molasses and fed with hydrolysate after 24 h and, in consequence, the inhibitors interference was prevented in the adaptation phase of the microorganism. In this pulse-fed scheme, Clostridium saccharoperbutylacetonicum DSM 14923 was able to co-ferment xylose, sucrose, glucose and fructose in a fermentation that contained a molasses-to-hydrolysate volume ratio of 3:1. The butanol yield was 0.31 g·g-1 and its concentration of 10.00 g·L-1 after 72 h of fermentation. In the second part, the capacity of strain to ferment diluted molasses directly in the non-detoxified hemicellulose hydrolysate was evaluated in the repeated batch scheme with cell immobilization. The strain was not able to ferment the mixture of hydrolysate and molasses in simple batch; because of this, the experiment in the repeated batch scheme (the amount of non-detoxified hydrolysate in the fermentation broth increases in three stages) began with the immobilizing agent and using diluted molasses in the first or first two batches (stage 1) to strength the beginning of the microorganism's growth and cell immobilization. The next batch was carried out in the pulse-fed scheme (molasses/hydrolyzate ratio) was 1:3 (stage 2, where the microorganism is introduced gradually to get contact with the inhibitors). The following batches were loaded with molasses diluted directly in the crude hydrolysate and supplemented with nutrients (stage 3). The results showed that using sugarcane bagasse as an immobilizing agent, in the sixth batch (stage 3) the conversion of xylose and sucrose were 44.68 % and 71.37 %, respectively, with a butanol yield of 0.19 g·g-1 and concentration of 3.90 g·L-1 after 360 h of fermentation. Using the 3D pieces, in the fifth batch (stage 3) the conversion of xylose and sucrose were 37.38 % and 81.39 %, respectively, with a butanol yield of 0.22 g·g-1 and concentration of 4.18 g·L-1 after 288 h of fermentation. Therefore, the results demonstrated that a 3D piece can be used as a cell immobilizing agent for solventogenic clostridia. However, it was the bagasse that had a better performance than the 3D piece in the repeated batch experiments, since the average xylose conversion during stage 3 was 36 %, while in the case of the 3D piece, it was only 16 %. Thus, for the condition tested with bagasse, 41 % of the total butanol produced during 360 h corresponded to butanol of second-generation, showing as a result that the culture was able to withstand the inhibitor stress (not just the acid acetic, but also of the phenolic compounds) and fermentation did not cease when challenged by the conditions of stage 3.DoutoradoEngenharia QuímicaDoutora em Engenharia Quimica152086/2015-32018/23983-3CNPQFAPES