RUXOLITINIB E PIMOZIDE COMO NOVAS ABORDAGENS TERAPÊUTICAS NA LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaA leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma neoplasia hematológica heterogénea caracterizada pela progressiva acumulação de linfoblastos essencialmente na medula óssea e sangue periférico. Esta doença afeta, principalmente, crianças em cerca de 80% dos casos, e o auge da doença ocorre entre os 2 e os 5 anos de idade. Modificações genéticas que ocorrem nas células progenitoras da linhagem linfoide, provocam alterações no normal processo de diferenciação dos linfócitos, levando a que ocorra a proliferação anormal de células imaturas. De facto, a LLA é caracterizada por alterações cromossómicas e genéticas que definem grupos geneticamente distintos. A identificação destas alterações estruturais é de extrema importância, de modo a que seja feito um correto diagnóstico da doença, com vista à determinação do nível de risco e ao desenvolvimento de terapias dirigidas a estas alterações.A via de sinalização celular JAK-STAT está envolvida em diversos processos celulares que regulam não só a hematopoiese e a diferenciação linfoide, mas também a proliferação e a sobrevivência celular. Alterações que ocorrem nesta via e que provocam uma desregulação da mesma, estão envolvidas no desenvolvimento de diversas doenças hematológicas onde se inclui a LLA. A aberrante ativação da via é provocada por alterações genéticas em diversos componentes onde se incluem mutações nos genes que codificam as proteínas JAK2, STAT5 e calreticulina. Este comprometimento da via leva a que ocorra uma desregulação nos normais processos que regulam a proliferação e sobrevivência celular, levando a uma proliferação e sobrevivência descontroladas de células leucémicas. Deste modo, a via de sinalização JAK-STAT constitui um alvo terapêutico bastante atrativo para o desenvolvimento de novos fármacos neste tipo de leucemia.Este trabalho teve como principais objetivos a caracterização dos níveis de expressão do gene que codifica a calreticulina (CALR), assim bem como a identificação de possíveis mutações do mesmo gene nos 5 modelos de LLA. Adicionalmente, procurou-se avaliar o potencial terapêutico de dois fármacos inibidores da via JAK-STAT, o ruxolitinib (RUX) e o pimozide (PIM). Para este fim, foram utilizados 5 modelos de LLA, as linhas celulares 697 e REH que correspondem a células do tipo B, e as linhas CEM, JURKAT e MOLT4 que são células do tipo T. A avaliação dos níveis de expressão do CALR foi feita através de PCR quantitativo em tempo real, e a deteção de mutações por sequenciação de Sanger. Para avaliar o potencial terapêutico dos fármacos RUX e PIM na viabilidade celular, as linhas celulares utilizadas foram expostas a diversas concentrações destes inibidores em diferentes esquemas terapêuticos que incluíram a administração em toma única e diária, assim como a associação terapêutica entre os dois fármacos. Posteriormente, foram analisados os níveis de proliferação recorrendo ao ensaio da resazurina. A morte celular induzida pelos fármacos foi analisada através de citometria de fluxo, usando a dupla marcação da anexina-V e 7-AAD, e por microscopia óptica, através da análise morfológica com a solução de May-Grünwald-Giemsa. Por fim, o ciclo celular foi analisado por citometria de fluxo, utilizando o marcador de ADN, o iodeto de propídio. Relativamente à expressão do gene CALR, as linhas celulares em estudo apresentaram níveis de expressão semelhantes, com a excepção da linha celular JURKAT onde foi detectada uma maior expressão deste gene. Adicionalmente, não foi detectada nenhuma mutação envolvendo o exão 9 do gene CALR nas linhas celulares testadas. O RUX demonstrou ter um efeito dependente do tempo de incubação, da linha celular e do esquema de administração. Este fármaco teve um efeito citotóxico nas linhas celulares em estudo, mediado pela activação da apoptose, porém não apresentou qualquer efeito citostático. Por outro lado, o PIM também demonstrou ter um efeito não só dependente da dose administrada e do tempo, mas também da linha celular e do esquema de administração nestes modelos de LLA. A apoptose foi o principal tipo de morte induzida pelo PIM nas linhas celulares, tendo sido confirmada através de citometria de fluxo e da análise dos aspetos morfológicos característicos da morte celular por apoptose, por microscopia ótica. Adicionalmente, o PIM teve um efeito citostático na linha celular JURKAT, induzindo um bloqueio do ciclo celular na fase G0/G1. Para finalizar, a combinação dos dois fármacos, RUX e PIM, não teve qualquer efeito sinérgico nas linhas celulares.Concluindo, estes resultados sugerem que os inibidores da via JAK-STAT, RUX e PIM, podem constituir uma promissora abordagem terapêutica na leucemia linfoblástica aguda, onde a sua eficácia poderá estar associada às diferenças genéticas.Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is a heterogeneous haematological neoplasia characterized by progressive and abnormal accumulation of lymphoblasts in the bone marrow, blood and extramedullary sites. This malignancy affects, predominantly, children which represents about 80 % of ALL cases, and the peak age is between 2 and 5 years of age. Genetic alterations that occur in lymphoid progenitor cells cause impairment of the normal differentiation process leading to proliferation of immature cells. In fact, the hallmarks of ALL are chromosomal aberrations and genetic alterations, that define genetic distinct groups. The identification of these structural alterations has been important for establishment of correct diagnostic, risk determination and development of targeting therapies.JAK-STAT is an essential signalling pathway involved in many cellular processes, including regulation of hematopoiesis, lymphoid differentiation, cell proliferation and survival. Dysregulation of JAK-STAT has been implicated in the development of hematological malignancies, including ALL. Several genetic alterations in key components of this signalling cascade, including JAK2 and STAT5 mutations as well as mutations in CALR gene, activate constitutively JAK-STAT signalling. Aberrant activation of JAK-STAT signalling compromise the regulation of normal cellular processes leading to uncontrolled proliferation and survival of leukemic cells. Therefore, JAK-STAT pathway is an attractive therapeutic target for development of new drug inhibitors to treat this leukemia.The aims of this work were to characterize five in vitro ALL models for CALR expression and mutations and evaluate the therapeutic potential of two JAK-STAT inhibitors Ruxolitinib (RUX) and Pimozide (PIM). For this purpose, we used five distinct in vitro models of ALL: 697 and REH cells as B-ALL models, and CEM, JURKAT and MOLT4 cells as models of T-ALL. The CALR expression was evaluated by qRT-PCR and CALR mutations by Sanger sequencing. To evaluate the therapeutic potential of RUX and PIM on cell viability, all cell lines were treated in presence and absence of increasing concentrations of both inhibitors in different therapeutic schemes and analysed by resazurin assay. Cell death was evaluated by flow cytometry (FC), using the double staining of annexin-V and 7-AAD, and by optic microscopy, using May-Grünwald-Giemsa staining. Finally, cell cycle was analysed by FC, using propidium iodide staining of DNA content.In terms of CALR expression, ALL cell lines presented similar levels of expression with exception of JURKAT cell line, where high CALR expression was detected. Additionally, no CALR mutations on exon 9 were found in any of these cell lines. The effect of RUX in ALL models was time, cell line and scheme of drug administration dependent. This drug presented a cytotoxic effect mediated by apoptosis activation and no cytostatic effect was observed in the studied cell lines. On the other hand, PIM revealed an effect time, dose, cell line and scheme administrations dependent in the five ALL models. Mechanistically, apoptosis was the predominantly mechanism of cell death, proved by flow cytometry and morphological analysis. Additionally, in JURKAT cell line, this inhibitor also induced a cytostatic effect, with cell cycle arrest at G0/G1 phase. The combination of both JAK-STAT inhibitors, RUX and PIM, in our models did not presented an additive or synergistic effect. In conclusion, our results suggest that JAK-STAT inhibitors, RUX and PIM, may constitute a potential therapeutic approach in acute lymphoblastic leukemia, being the efficacy related with different genetic backgrounds