Isolamento e cristalização de estados oligoméricos de cistatinas de plantas

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2020.As cistatinas das plantas representam uma subfamília das cistatinas (Cys), também conhecidas como Fitocistatinas (PhyCys), sendo caracterizadas como proteínas inibidoras das enzimas cisteíno–proteases (Cys–Prot). A atividade proteica das PhyCys pode ser controlada por meio da oligomerização do tipo troca de domínios (domain swap), um evento de dimerização em que as proteínas trocam elementos de estrutura secundária, formando um dímero sem atividade inibitória. As PhyCys são inibidoras de proteases exógenas e endógenas, regulando vários processos fisiológicos como: tolerância a diferentes tipos de estresses bióticos (produzidos por fungos, bactérias e insetos) e abióticos (frio, calor e sal) tornando–as interessantes alvos de pesquisa. Os estudos das PhyCys potencializam que estas sejam ferramentas biotecnológicas aplicadas na agricultura. A presente pesquisa visou selecionar, clonar, expressar, purificar e caracterizar PhyCys. Por meio de análises, de bioinformática, em banco de dados, foram avaliadas várias PhyCys de relevância econômica, resultando na escolha de duas PhyCys, uma da Junglas regia (NOG1) e outra do Coffea arabica (CAF1). As PhyCys utilizadas nesta pesquisa foram obtidas por expressão heteróloga, utilizando as cepas de Escherichia coli (E. coli) Lemo21 (DE3) cultivadas em meio auto–indutor ZYM–5052, pois essas condições apresentaram melhor expressão solúvel de NOG1 e CAF1. As proteínas foram purificadas por cromatografia de afinidade a metal e cromatografia de exclusão molecular (SEC). As purificações de NOG1 resultaram em maior quantidade de dímeros, contudo foram observados também monômeros, e para a CAF1 foram observados principalmente monômeros. A SEC foi utilizada em ensaios de estabilidade térmica e nos ensaios de oligomerização das PhyCys. As PhyCys foram incubadas em diferentes temperaturas (T) e as duas PhyCys se mostraram estáveis em gelo. Após incubação por diferentes períodos em intervalos discretos de 20 °C a 70 °C foi possível monitorar a conversão da forma monomérica na forma dimérica, e vice–versa. Os resultados demonstram que as mudanças no estado oligomérico das PhyCys ocorreram em função da temperatura, do tempo de incubação e da concentração. As triagens para obtenção de cristais foram realizadas com o auxilio do robô Mosquito® em diferentes condições, depois refinadas manualmente, e os cristais obtidos foram submetidos à coleta de dados de difração de raios–X in–house em um difratômetro D8 VENTURE (Bruker). Dados obtidos a 3,1 Å de resolução provenientes de cristais monoclínicos de grupo espacial C 1 2 1 da NOG1 foram resolvidos por substituição molecular. Foram observados dois dímeros por troca de domínios na unidade assimétrica.Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP/DF) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Plant cystatins, also known as phytocystatins (PhyCys) represent a subfamily of cystatins (Cys), and are proteins that inhibit the enzymes cysteine–proteases (CysProt). The protein activity of PhyCys can be controlled through domain swap oligomerization. In the dimerization process, proteins exchange elements of secondary structure, forming a dimer without inhibitory activity. PhyCys are inhibitors of exogenous and endogenous proteases, acting in tolerance to different types of biotic stresses (produced by fungi, bacteria and insects) and abiotic (cold, heat and salt) making them interesting targets for research, and as possible biotechnological tools to be employed in agriculture. The present research aimed to select, clone, express, purify and characterize PhyCys. Several PhyCys of economic relevance were evaluated, resulting in one from Junglas regia (NOG1) and another from Coffea arabica (CAF1). In order to obtain the PhyCys used in this research, the heterologous expression process was carried out in a prokaryotic system using the pET24a expression vector. In the expression tests, the strains of Escherichia coli (E. coli) Lemo21 (DE3), grown in a self–inducing medium ZYM–5052, were more efficient, both in the production of NOG1 as well as CAF1. The proteins were purified by metal affinity chromatography and molecular exclusion chromatography (SEC). The purifications of NOG1 resulted in a greater amount of dimers, however, monomers and tetramers were also observed, and for CAF1, mainly monomers were observed. SEC was used in thermal stability tests and in PhyCys oligomerization tests. The PhyCys were incubated at different temperatures (T) and the two PhyCys were stable in ice. After incubation for different periods at discrete temperature intervals it was possible to monitor the conversion from monomer to dimer, and vice–versa. The results demonstrate that the changes in the PhyCys oligomeric state occurred as a function of temperature, incubation time and concentration. The screenings for obtaining crystals were performed with the help of the Mosquito® robot in different conditions, and then manually refined. The obtained crystals were subjected to in– house X–ray diffraction on a D8 VENTURE diffractometer (Bruker). Data obtained at 3.1 Å resolution from monoclinic crystals of space group C 1 2 1 of NOG1 were resolved by molecular substitution. Two domain–swapped dimers were observed in the asymmetric unit