Analysis of protein complexes in vivo by native mass spectrometry

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020Conhecer a estrutura de uma proteína é uma das características mais importantes para perceber qual a atividade biológica da mesma. Sendo a estrutura tridimensional de uma proteína uma das características mais importantes para compreender a sua função, várias técnicas foram desenvolvidas ao longo do tempo para obter informação sobre a mesma. Entre estas destacam-se a cristalografia de raio-X, a ressonância nuclear magnética e a cryo-EM. Contudo, a necessidade de utilizar uma grande quantidade de amostra e existência de limitações para complexos quaternários de elevada massa molecular eram algumas das desvantagens destas técnicas. No entanto, nos últimos anos, a espetrometria de massa tem vindo a tornar-se uma abordagem cada vez mais usada em biologia estrutural e molecular, devido ao grande avanço tecnológico dos instrumentos utilizados. O desenvolvimento de técnicas de ionização suaves e o surgimento do nano electrospray permitiu que pequenas quantidades de amostra fossem analisadas através desta técnica, trazendo muitas vantagens em comparação com as técnicas disponíveis para o estudo da estrutura de uma proteína. Com o aparecimento da espetrometria de massa nativa passou a ser possível a análise de complexos proteicos intactos e, com esta abordagem, informações como a massa molecular, a estequiometria e a topologia dos complexos proteicos passou a ser imediatamente conhecida. Uma das características da espetrometria de massa é a necessidade de purificação da amostra para que esta pudesse ser analisada e produzisse um espetro claro. No entanto, os tampões utilizados durante a purificação de complexos proteicos contêm sais e agentes solubilizantes incompatíveis com espetrometria de massa. Para além disso, durante o processo de purificação, o complexo passa por vários passos que podem levar à perda das ligações não covalentes e à alteração da conformação do mesmo. A purificação é também uma desvantagem no estudo de complexos proteicos, uma vez que não têm em conta o efeito de crowding macromolecular que controla as interações entre proteínas na célula. Assim, a purificação limita a informação obtida sobre estas interações. Contudo, recentemente foi desenvolvido um método que permite a análise de proteínas diretamente do extrato celular, sem necessidade de purificação. Para tal, é necessário que a proteína seja sobre expressa e a sua abundância relativa seja superior às proteínas endógenas para que o sinal que produz seja dominante no espetro de massa. Adicionalmente, para estudos estruturais é necessário usar a ionização por nanoESI, ainda mais suave e eficiente que o ESI mas cuja implementação é muito variável entre diferentes espetrómetros de massa e requer considerável otimização para o estudo de proteínas no seu estado nativo. Deste modo, o estudo de complexos proteicos no estado nativo a partir do extrato celular através de espetrometria de massa exige a necessidade de ajustar parâmetros para ser possível ionizar a proteína, mas não destruir as ligações não covalentes que mantêm o complexo proteico. Deste modo, o objetivo principal do trabalho é a otimização de um método que permita melhorar a eficiência de ionização e a transmissão de complexos proteicos diretamente de um extrato celular crude e que possa ser usado em diferentes espetrómetros de massa. Para tal foi necessário o desenvolvimento de capilares adequados, que maximizassem a ionização de complexos proteicos, a otimização da expressão proteica e da preparação da amostra e por fim, o ajuste dos parâmetros para a transmissão de iões com m/z elevado num Q-TOF e num FT-ICR. Estes dois espetrómetros de massa partilham algumas características comuns ao nível da sua ótica de iões, mas têm características muito distintas entre si e que podem ser exploradas no âmbito de estudos estruturais. Como modelo foi usado o complexo proteico glioxalase I de Leishmania infantum, uma vez que é um homodímero, cujas interações são mantidas por ligações não covalentes, e a sua estrutura determinada por cristalografia é conhecida. Para otimizar a transmissão do sinal e melhorar o espetro dos complexos proteicos, um dos aspetos mais importantes é o processo de ionização. A forma do capilar utilizado influência a qualidade do espetro, uma vez que controla o fluxo. Quanto menor for o diâmetro da ponta do capilar, melhor a eficiência de ionização. Assim, foram produzidos diversos capilares, tendo sido obtido a variação da corrente iónica e os respetivos espetros. Como amostras foram utilizadas duas proteínas, a mioglobina, uma proteína monomérica com cerca de 17 kDa e o álcool desidrogenase, uma proteína tetramétrica com cerca de 147 kDa, ambas no estado desnaturado e nativo. Durante o estudo com o álcool desidrogenase foi possível acompanhar a formação da estrutura tetramérica, uma vez que ao longo do tempo se viu a diminuição da intensidade da espécie monomérica e o aumento da espécie tetramérica. O facto de não se detetar a espécie dimérica sugere que a cinética de formação desta espécie é demasiado rápida para ser detetada por espetrometria de massa com o método utilizado. Para otimizar a qualidade do espetro, as condições de expressão da amostra foram também otimizadas. Foram testados dois meios de cultura, LB e TB. O meio TB, sendo um meio nutricionalmente rico foi capaz de induzir a expressão da proteína, mesmo sem a adição de indutor e a quantidade produzida foi suficiente para a proteína dominar o espetro. A temperatura de expressão também foi otimizada e observou-se que a expressão foi maior quando o crescimento foi induzido a 28ºC, temperatura a qual ocorre a expressão no parasita, em comparação com o crescimento a 37ºC. Assim, para a otimização dos parâmetros que permitem o estudo dos complexos proteicos a partir do extrato celular nos espectrómetros de massa, a expressão da proteína foi induzida a 28ºC em meio TB. Apesar de o Q-TOF ser um espetrómetro de massa modificado para a transmissão de iões com elevado m/z, parâmetros como a temperatura da fonte e a voltagem da energia de colisão foram otimizados para melhorar a transmissão de complexos proteicos a partir do extrato celular. A temperatura demonstrou não influenciar a conformação da proteína, não havendo diferença na distribuição dos estados de carga obtidos com a temperatura da fonte a 37º e a 100ºC. Uma voltagem de 30 V demonstrou ser a que melhora a qualidade do espetro, uma vez que diminui a intensidade de outros picos não correspondentes à proteína, aumentando a intensidade do sinal pretendido. Por sua vez, uma energia de colisão demasiado baixa como 10 V, levou a um aumento da intensidade de outros picos e uma voltagem demasiado alta levou à alteração da conformação da proteína, uma vez que ocorre o aparecimento de estados de carga superiores. No entanto, 100 V não foi suficiente para destruir as ligações não covalentes, uma vez que a espécie monomérica não apareceu no espetro. Com estes resultados foi possível concluir que a elevada temperatura da fonte não foi capaz de destruir as ligações não covalentes, produzindo o melhor espetro quando combinada com uma energia de colisão de 30 V. Para a análise do complexo proteico através do FT-ICR foi utilizada uma fonte de nano-electrospray em desenvolvimento. Os espetros obtidos apresentavam uma distribuição dos estados de carga menores e mais ruído, quando comparados com os obtidos por Q-TOF, devido à presença de aductos típicos de espetros nativos. No entanto, foi possível observar a presença do dímero e não foram detetados picos correspondentes ao monómero, indicando que não ocorreu dissociação durante o processo de ionização, embora tenha sido usada uma energia de colisão de 30 V, que melhorava a qualidade do espetro. Demonstrou-se ser possível estudar a estrutura de uma proteína a partir do extrato celular por espetrometria de massa nativa, sem necessidade de purificação, preservando as condições do complexo no interior da célula, tanto no Q-TOF previamente modificado para transmissão de iões de elevado m/z, como no FT-ICR através do ajuste de parâmetros que permitem a transmissão e análise de iões de elevado m/z.Knowing the structure of a protein is one of the most important characteristics to understand its biological activity. However, when a protein is analysed in a purified form there are a lot of information that is not obtained. The crowded intracellular environment is essential in the control of protein interactions and all the information about these is lost when a protein pass through a purification system. In this way, characterization of intact protein complexes must be done with the minimum change in the environment of the protein. This goal can be achieved using the analysis of protein direct from crude cell lysate, without purification steps, by native mass spectrometry. For this it is necessary that the protein is overexpressed and its relative abundance is superior to the endogenous proteins so that the produced signal dominates the spectrum. To study protein complexes and protein interactions directly from crude cell lysate in Q-TOF and FT-ICR mass spectrometers, instrumental workflow optimisation is needed. So, the main objective is the optimisation of a method that improves the efficiency of ionisation and transmission of protein complexes from a cell extract in different mass spectrometers. For that, it was necessary the development of adequate emitter tips, which maximize the ionisation of protein complexes, the optimisation of protein expression and sample preparation and tunning parameters from high m/z ions transmission. As a model was used glyoxalase I from Leishmania infantum, since it is a homodimer with non-covalent bonds and the structure determined by crystallography is known. The ionisation process is one of the most important aspects in optimising transmission of protein complexes. The shape of the emitter tip used influence the quality of the spectrum, smaller the tip diameter, better the efficiency. Several emitter tips were produced, having obtained the variation of ion current over time and the respective spectra. Myoglobin and alcohol dehydrogenase were used as samples to test the efficiency of ionisation. To optimise the expression conditions, two medium cultures (LB and TB) and two temperatures (28ºC and 37ºC) were tested. The conditions that maximized expression were the growth in TB medium at 28ºC. With this condition it was possible to obtain enough protein to dominate the spectrum, maximizing the ionisation and transmission of protein complex. Although the Q-TOF is a mass spectrometer modified for high m/z transmission, parameters such as source temperature and collision energy showed changing the quality of spectrum, having been observed that source temperature of 100ºC and 30 V of collision energy improved the transmission of protein complexes, maintaining their structure. For the characterization of complex in FT-ICR mass spectrometer, a source under optimisation was used. Although a lower distribution of charge states was showed when compared with Q-TOF, it was possible to observe the presence of the dimer without dissociation, even though collision energy of 30 V was used. With this work, it was possible to characterize the structure of a protein complex from the cell extract by native mass spectrometry using two different mass spectrometers, without the need of purification, preserving the conditions of the complex inside the cell