The impact of BDNF receptor cleavage in Alzheimer's disease-associates Neuroinflammation

Tese de mestrado em Bioquímica (Bioquímica Médica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021A Doença de Alzheimer (Alzheimer’s disease, AD) é atualmente considerada a forma mais prevalente de demência a nível mundial, representa 60-80% dos casos diagnosticados. É uma doença neurodegenerativa progressiva do cérebro e divide-se em duas formas de doença: a familiar que afeta preferencialmente pessoas com idade inferior a 65 anos e a esporádica que afeta maioritariamente pessoas com idade acima dos 60 anos. Sendo esta uma doença relacionada com o envelhecimento, e sendo que atualmente a esperança média de vida tem vindo a aumentar, em Portugal estima-se que 5,9% das pessoas com mais de 60 anos possuam demência. Esta patologia é caracterizada por perda neuronal que culmina em défices cognitivos e numa diminuição do volume cerebral. Estas consequências provêm de alterações moleculares características desta patologia como é o caso da hiper-fosforilação da proteína tau - levando à formação de fibrilhas - e a acumulação do péptido Beta-Amilóide (Aβ) que tem propensão para agregar e formar placas amilóides. Tais alterações provocam danos cognitivos na memória, disfunção sináptica e perda de neuroprotecção. Foi descoberto que em algumas doenças neurodegenerativas, como a AD, que são caracterizadas por um declínio cognitivo e perda de memória, a sinalização mediada pelo factor neurotrófico derivado do cérebro (Brain-derived neurotrophic factor, BDNF) se encontra diminuída. O BDNF é uma neurotrofina importante uma vez que desempenha funções cruciais a nível fisiológico no sistema nervoso central, participando em mecanismos como a diferenciação, sobrevivência e crescimento neuronal bem como em processos de plasticidade sináptica. Existem estudos que demonstram que os níveis de BDNF e do seu recetor tirosina cinase de forma completa, TrkB-FL (full-length isoform of tropomyosin-related receptor B) se encontram diminuídos, tanto em modelos animais como em amostras post-mortem recolhidas a doentes com AD. Adicionalmente, o BDNF tem a capacidade de se ligar a várias isoformas truncadas dos recetores TrkB (truncated TrkB, TrkB-Tc), no entanto estes recetores são modeladores negativos dos recetores TrkB dado que não possuem o domínio tirosina cinase intracelular, essencial para a ativação das vias de sinalização mediadas pelo BDNF. Recentemente, vários estudos tiveram como principal foco de investigação a tentativa de perceber ao detalhe qual o mecanismo fundamental através do qual a sinalização mediada pelo sistema BDNF/TrkB-FL se encontra desregulada no contexto de AD. Os ensaios revelaram que a acumulação de Aβ, característica da AD, leva a uma sobre ativação dos recetores N-metil-D-aspartato extrasinápticos (eNMDARs) - importantes mediadores da plasticidade sináptica e permeáveis ao cálcio - o que possibilita uma maior passagem e acumulação de cálcio no interior da célula. O aumento exorbitante de cálcio no espaço intracelular resulta na ativação de um grupo específico de proteases, denominados por calpaínas (dependentes de cálcio), que vão clivar os recetores TrkB-FL. Desta proteólise advém a formação de um novo recetor, TrkB truncado (TrkB-T’) e de um fragmento intracelular (intracelular domain, TrkB-ICD) que com o passar do tempo é translocado e se acumula no núcleo. Para além disso, o fragmento TrkB-ICD é estável e tem a capacidade de fosforilar proteínas neuronais e axonais. Nos últimos anos, a neuroinflamação tem sido apontada como um importante componente patofisiológico na AD, que contribui para a progressão e agravamento da doença. A neuroinflamação consiste na inflamação do tecido nervoso e na ativação do sistema imune inato no cérebro, que tem como função central a proteção do sistema nervoso contra infeções, ferimentos e/ou doença, como acontece neste caso concreto. Esta reação inflamatória requer uma combinação de respostas e ativações de células gliais especificas do sistema nervoso central (SNC), que incluem a microglia, os astrócitos, entre outras. A microglia é considerada o macrófago residente do SNC e pode apresentar-se num estado de vigilância não-polarizado enquanto a homeostase cerebral é mantida, mas quando existe um estímulo esta pode rapidamente polarizar ficando ativa. Dependendo do estímulo e da sua magnitude, estas células quando ativadas podem exibir diferentes fenótipos: podem apresentar-se 1) num estadio neurotóxico e pró-inflamatório, onde são libertadas citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias ou 2) num estadio antinflamatório e de recuperação, em que há a secreção de citocinas anti-inflamatórias e remoção de detritos celulares. Relativamente aos astrócitos, estes são as células mais abundantes do SNC e participam num vasto número de processos essenciais à homeostase cerebral, como por exemplo a captação de neurotransmissores em excesso, modulação e transmissão sináptica, processos inflamatórios, entre outros. Estas células também podem existir sobre várias formas, distinguidas pela diferente morfologia, fenótipo ou distribuição, assim como a microglia estas células também têm a capacidade de libertar citocinas pró-inflamatórias em situações especificas, como é o caso da AD. Descrições da literatura referem que em contexto de AD, a microglia e os astrócitos são ativados pela presença de oligómeros e fibrilhas provenientes da acumulação de Aβ. Paralelamente, as regiões mais afetadas nesta doença são o hipocampo e o córtex, observando-se uma reação inflamatória primeiramente nestas áreas. Estes fatos, juntamente com a inexistência de tratamento para esta doença que afeta um elevado número da população a nível mundial, levou a que fossem levantadas várias questões às quais este trabalho tentou dar resposta. Assim, o objetivo global deste trabalho é o estudo do impacto da clivagem do recetor TrkB-FL na neuroinflamação em contexto de AD. Sabendo que o TrkB-ICD é um fragmento que se acumula no núcleo e que tem a capacidade de fosforilar proteínas nucleares e axonais, o primeiro objetivo é perceber se a sobre-expressão do fragmento TrkB-ICD per se é um estímulo suficientemente poderoso para dar origem a reações inflamatórias exacerbadas. Para isso, foram injetadas no hipocampo de ratinhos partículas virais induzindo a expressão do TrkB-ICD apenas em neurónios piramidais e, após dois meses de expressão, vários testes moleculares foram efetuados. O segundo objetivo prende-se com o ensaio de uma estratégia farmacológica para prevenir a clivagem dos recetores TrkB-FL e por consequente a perda de função do BDNF. Um dos grupos onde este trabalho foi realizado desenvolveu um péptido, TAT-TrkB, que previne a clivagem dos recetores TrkB-FL evitando a perda de função do BDNF e consequentes vias de sinalização. Para isso foi estudado o impacto da administração intraperatoneal diária de TAT-TrkB (25 ou 50 mg/kg) num modelo animal de AD, 5xFAD, tendo posteriormente estes animais sido sujeitos a vários testes comportamentais e a estudos moleculares. Os resultados obtidos neste projeto revelam que a sobre-expressão do fragmento TrkB-ICD não é um estímulo suficientemente forte para desencadear um processo de neuroinflamação generalizado, no entanto é possível que esta sobre-expressão induza alterações focais nos locais de expressão. A memória de reconhecimento dos ratinhos foi avaliada utilizando o teste “reconhecimento do objeto novo” (Novel Object Recognition test, NORt) onde se quantifica o tempo despendido a explorar os objetos e se existe preferência de exploração de um objeto específico. No entanto, os resultados obtidos não demonstraram uma recuperação dos danos cognitivos depois da administração de TATTrkB (25 ou 50 mg/kg) no modelo animal de AD. Curiosamente, os animais controlo também não apresentaram um perfil de aprendizagem no fim deste teste. Para além dos testes comportamentais, parâmetros moleculares como: níveis de TrkB-FL, TrkB-ICD, disfunção sináptica e neuroinflamação foram avaliados nestes animais. Como seria de esperar, os animais 5xFAD apresentaram uma elevada prevalência de inflamação comparativamente aos animais controlo, assim como uma diminuição da função sináptica, demonstrada por uma diminuição da presença da proteína pós-sináptica de densidade 95 (PSD-95). Curiosamente, a administração de TAT-TrkB permitiu uma recuperação dos níveis de PSD-95. Em suma, os resultados obtidos neste projeto sugerem que: 1) A sobre-expressão do fragmento TrkB-ICD não é um estímulo suficientemente forte para provocar uma resposta inflamatória generalizada; 2) O péptido TAT-TrkB parece promover a recuperação de alguns marcadores que estão alterados nos animais 5xFAD. Este projeto apresenta alguns resultados promissores, no entanto como se trata de um estudo preliminar é necessário complementar estes ensaios com análises mais específicas. Para validação do TAT-TrkB como possível terapia será necessário desenvolver vários ensaios, incluindo ensaios farmacocinéticos, farmacodinâmicos e avaliar as interações célula-péptido de forma a perceber qual será a melhor estratégia terapêutica associada à administração de TAT-TrkB.Alzheimer’s disease (AD) is a progressive neurodegenerative disorder, considered the most common form of dementia worldwide (60-80% of the cases), affecting mainly the cerebral cortex and the hippocampus, a region mainly associated with learning and memory. AD affects predominantly the elderly population, however, this disorder can be divided into two types: 1) familial form, affecting mainly people below 65 years old and responsible for 1-5% of the cases and 2) sporadic form, that affects mostly people above 65 years old responsible for 95-99% of all cases. AD is characterized by the accumulation of both amyloid-beta (Aβ) and neurofibrillary tangles, molecular alterations responsible for cognitive impairment, synaptic dysfunction, and loss of neuronal protection. The signalling pathways mediated by the Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are strongly impaired in AD, leading to alterations in neuronal growth, differentiation, survival, and synaptic plasticity. Several reports showed that brains of AD patients revealed decreased levels of BDNF and its receptor, Tropomyosin-receptor kinase B-full-length (TrkB-FL), along with increased levels of truncated TrkB (TrkB-Tc), which are negative modulators of TrkB-FL. Interestingly, the cleavage of TrkB-FL was discovered as a novel feature of the AD pathophysiology. This cleavage is induced by Aβ accumulation, overactivating extrasynaptic N-methyl-D-Aspartate receptor (eNMDAR) and thus allowing an increase of intracellular Ca2+ levels. Consequently, this will result in an exacerbated activation of calpains, culminating in TrkB-FL cleavage. This cleavage generates two fragments: a membrane-bound truncated receptor (TrkB-T’) and an intracellular fragment (TrkB-ICD). TrkB-ICD is a stable fragment, which has tyrosine kinase activity and accumulates into the nucleus over time, through a phosphorylation-dependent process, leads to the phosphorylation of nuclear and axonal proteins. Increased levels of TrkB-ICD and decrease levels of TrkB-FL were reported in post-mortem brain samples of AD patients. Neuroinflammation has been emerging as a crucial player in AD pathophysiology. In AD, the inflammatory reaction occurs in susceptible regions of the brain and it is triggered by immune cells of the central neuronal system (e.g. microglia and astrocytes) as a response to an initial stimulus, such as misfolded proteins or Aβ plaques. With the major goal of studying the impact of TrkB-FL cleavage in neuroinflammation associated with AD and in order to reach new findings that help to uncover AD pathophysiology, two main objectives were described for this project: 1) the evaluation of the impact of TrkB-ICD overexpression in neuroinflammation in healthy mice, and 2) the assessment if prevention of TrkB-FL cleavage by a new drug, TAT-TrkB peptide, prevents AD-associated phenotype in a mouse model of AD (5xFAD). The results obtained in this project show that TrkB-ICD overexpression does not trigger an overall synaptic dysfunction nor neuroinflammation in healthy mice, aside from a very focal glial reactivity. Concerning TAT-TrkB performance, no conclusive results were obtained, however, the findings may suggest that TAT-TrkB is able to recover some molecular features that are altered in 5xFAD animals. Importantly, this is an exploratory project with very promising preliminary results that need to be validated and for that further studies are necessary