Study of coatings based on polyelectrolytes and polyzwitterions for the separation of proteins by capillary electrophoresis

L’objectif de cette thèse est d’étudier différentes natures de revêtements de la paroi interne des capillaires pour la séparation de protéines modèles (lysozyme, β-lactoglobuline A, ribonucléase A, myoglobine et inhibiteur de trypsine) en milieu acide par électrophorèse capillaire. Les séparations ont été réalisées en utilisant un électrolyte volatil compatible avec un couplage avec la spectrométrie de masse. Le premier chapitre est consacré à l’étude de revêtements à base de multicouches de polyélectrolytes en faisant varier la nature chimique des polyélectrolytes, le nombre de couches, le pH et la force ionique du milieu de construction. Plus de 20 couples de polyélectrolytes ont été testés. Il a été montré que la nature du polycation placé en couche terminale, mais aussi la nature du polyanion dans les couches intermédiaires, ont une très grande influence sur les efficacités de séparation et sur la répétabilité. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec le revêtement poly(diallyl dimethyl ammonium)/poly(L-lysine citramide) qui présente une excellente stabilité testée sur 100 analyses successives. Pour les revêtements les moins stables, la stabilité des revêtements peut être durablement améliorée par réticulation chimique des multicouches à l’intérieur du capillaire avec des efficacités de pics comparables. L’effet de la structure chimique du polyanion et du polycation a aussi été étudié en comparant notamment des poly(L-lysine) linéaires et ramifiées (dendrimères greffés de lysine de différentes générations). Le second chapitre est dédié à l’étude de la force ionique de l’électrolyte de séparation sur un capillaire modifié par des multicouches de polyélectrolytes. Par la représentation dite du « slope-plot », il a été démontré que la mobilité électrophorétique des protéines diminuait de 30 à 40 % par décade de force ionique par rapport à sa valeur à une force ionique de 5 mM. Les conditions optimales de séparation des protéines ont été obtenues à faible force ionique (5~10 mM). Le troisième chapitre s’intéresse aux revêtements monocouches à base de copolymères polyzwitterioniques connus pour leurs propriétés antiadhésives (ou antifouling). Les performances séparatives des revêtements poly(sulfobétaine méthacrylate-co-acide acrylique) (poly(SBMA-co-AA)) ayant différents taux de zwitterion ont été évaluées. L’influence du prétraitement du capillaire a également été étudiée sur le meilleur revêtement. Un lavage préalable du capillaire avec du méthanol, de la soude puis de l’acide chlorhydrique a donné les meilleurs résultats.The main objective of this thesis is to study different natures of capillary coatings for the separation of model proteins (lysozyme, β-lactoglobulin A, ribonuclease A, myoglobin and trypsin inhibitor) in acidic medium by capillary electrophoresis. Separations were performed in volatile electrolyte compatible with the coupling to mass spectrometry. The first chapter is devoted to the study of coatings based on polyelectrolyte multilayers by varying the chemical nature of the polyelectrolytes, the number of layers, and the pH and ionic strength of the construction medium. More than 20 polyelectrolyte couples have been tested. It has been demonstrated that the nature of the polycation placed on the terminal layer, as well as the nature of the polyanion located in intermediate layers, have a great influence on the separation performances and repeatability. Best results were obtained using poly(diallyl dimethyl ammonium chloride)/poly(L-lysine citramide) coating with an excellent stability tested on 100 successive runs. For unstable coatings, the coating stability can be permanently stabilized by chemical crosslinking of the multilayers with comparable peak efficiencies. The effect of chemical structure of polyanion and polycation was also studied by comparing linear and ramified poly(L-lysine)s (dendrigraft polylysine of different generations).The second chapter is dedicated to the influence of the background electrolyte ionic strength using polyelectrolyte multilayer coatings. Using the so-called "slope-plot" approach, it has been demonstrated that the electrophoretic mobility of proteins systematically decreases by 30-40 % per ionic strength decade compared to the value obtained at 5 mM ionic strength. Optimal protein separations was obtained using background electrolytes of low ionic strength (5~10 mM).The third section is focused on monolayer coatings based on polyzwitterionic copolymers known for their antiadhesive (antifouling) properties. Separation performances of poly(sulfobetaine methacrylate-co-acrylic acid) coatings with different monomer ratios have been evaluated. The influence of the capillary pretreatment was also studied on the best coating. A pretreatment of the capillary with methanol, sodium hydroxide and hydrochloric acid has given the best results