Deciphering molecular basis of the mechanism of transport mediated by the MmpL efflux pumps and study of the role of the Eis, N-acetyltransferases in antibiotic resistance in mycobacteria

Le tréhalose monomycolate (TMM) est un glycolipide majeur qui constitue la paroi atypique des mycobactéries. La protéine « Mycobacterial membran protein Large 3 » (MmpL3) transportant le TMM est essentielle à la croissance des bacilles. MmpL3 apparaît donc comme une cible thérapeutique prometteuse à exploiter pour contrer les infections à mycobactéries. Par des approches de biologie structurale et biochimiques, ce projet de thèse visait à comprendre les bases moléculaires du transport du TMM et le mode d'action des inhibiteurs ciblant cette voie. Dans cette finalité, un protocole de purification de MmpL3 a été établi. Nous avons obtenu des cristaux de MmpL3 permettant de résoudre la structure cristalline (S3D) de MmpL3 de Mycobacterium smegmatis. Par ailleurs, des études récentes ont démontré que MmpL3 agit en concert avec d’autres protéines pour le transport du TMM. Nous avons résolu la S3D d’un de ces partenaires, le facteur A de transport du TMM (TtfA) qui est essentiel à la survie des mycobactéries. TtfA possède un repliement unique et notre analyse bioinformatique suggère que la fonction de TtfA ne serait pas uniquement dédiée au transport du TMM. Les mycobactéries peuvent inactiver les antibiotiques de type aminoglycosides (AG) par acétylation. La protéine Eis2 (Enhanced Intracellular Survival) de M. abscessus (Mab) est importante pour la survie du bacille dans les macrophages. Nous avons pu montrer que Eis2, en plus de son rôle important dans la persistance intracellulaire, est capable de modifier les AG et en particulier l' amikacine (AMK), un antibiotique de base du traitement des infections à Mab. La S3D de Eis2, nous a permis d’ identifier plusieurs inhibiteurs de l’ enzyme. Nous avons également démontré que le site actif atypique de Eis1 de Mab, un homologue de Eis2, ne permet pas à l’ enzyme d’ inactiver les AG. Nos études génétiques permettent de conclure que Eis1 contrairement à Eis2 n’ est pas impliqué dans la résistance aux AG.Mycobacteria possess an atypical and hydrophobic cell wall which, limits the penetration of the antibiotics and drug-like molecules. Trehalose monomycolates (TMM) are glycolipids and building blocks of the mycomembrane. The Mycobacterial membrane protein Large 3 (MmpL3) mediates the TMM transport and is essential for bacilli growth. Several studies have highlighted MmpL3 as a promising drug target. To understand by structural and biochemical approaches the molecular basis of TMM transport and the mode of action of inhibitors targeting this pathway, we first established a robust purification protocol of MmpL3. We crystallized MmpL3 from several mycobacterial species, which allowed determination of the MmpL3 crystal structure (S3D) from Mycobacterium smegmatis. Recent studies demonstrated that MmpL3 requires several accessory proteins for efficient TMM transport. We could solve the S3D of one of these MmpL3 partners, the TMM transport factor A (TtfA) that was reported to be essential for the survival of mycobacteria. The TtfA S3D revealed a unique protein fold and bioinformatics analysis suggested that the TtfA function might not be solely dedicated to TMM transport. Mycobacteria can modify and inactivate antibiotics. The enhanced intracellular survival protein (Eis2) from M. abscessus (Mab) is important for invasion of the host and persistence. We could show by structural and biochemical approaches that Eis2, on top of its role in colonization, can modify by acetylation and thus inactivate several aminoglycosides (AG) and particularly amikacin (AMK), one of the cornerstone antibiotics for Mab infection treatment. Furthermore, by exploiting the Eis2 structural data, we found several inhibitors of Eis2 and could propose why apramycin an efficient anti-Mab AG is not inactivated by Eis2. We demonstrated also that the atypical active site of Eis1 from Mab a close homolog of Eis2 is not allowing the inactivation of AG. We could conclude that Eis1 contrary to Eis2 is not involved in AG resistance