Analysis of single cell gene expression reveals cellular heterogeneity and differentiation dynamics of an healthy airway epithelia

Les progrès technologiques en séquençage haut débit et en manipulation cellulaire permettent d'analyser simultanément et indépendamment le contenu de nombreuses cellules (ARN, ADN,...). Cette révolution "omique" offre un nouveau cadre pour revisiter la "Théorie Cellulaire", essentiellement basée sur des caractéristiques morphologiques et fonctionnelles. Les nombreuses modalités cellulaires désormais accessibles au niveau de la cellule unique, telles que leur transcriptome, leur localisation spatiale, leurs trajectoires développementales, enrichissent considérablement cette définition, et établissent un contexte totalement renouvelé pour réévaluer la définition de "types" ou d’"états" cellulaires ainsi que leurs interactions. \Mon travail de thèse a été de mettre en place des approches statistiques appropriées pour analyser ces données transcriptomiques sur cellule unique caractérisées par une forte variance, la présence d'un pourcentage élevé de valeurs nulles et un grand volume de données. Mon travail s’est focalisé sur le modèle expérimental central de mon laboratoire d’accueil, l'épithélium des voies respiratoires humaines. Les voies respiratoires humaines sont bordées d'un épithélium pseudo-stratifié composé principalement de cellules basales, sécrétrices, à gobelet et multiciliées. Les voies respiratoires constituent en outre un véritable écosystème cellulaire, dans lequel la couche épithéliale interagit étroitement avec les cellules immunitaires et mésenchymateuses. Cette coordination entre les cellules assure une bonne défense du système respiratoire et sa correcte régénération en cas d'agressions extérieures. Une meilleure compréhension des situations cellulaires normales et pathologiques peut améliorer les approches pour lutter contre des pathologies telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique, l'asthme ou la mucoviscidose.J'ai d'abord pu caractériser au niveau de la cellule unique la séquence précise et spécifique des événements conduisant à la régénération fonctionnelle de l'épithélium, en utilisant un modèle 3D de cellules humaines. J'ai identifié des hiérarchies de lignées cellulaires et j'ai pu reconstruire les différentes trajectoires possibles de différentiation cellulaire. J'ai confirmé des trajectoires cellulaires décrites précédemment, mais j'ai aussi découvert une nouvelle trajectoire reliant les cellules à gobelet aux cellules multiciliées, identifiant de nouvelles populations cellulaires et de nouvelles interactions moléculaires impliquées dans le processus de régénération de l'épithélium sain des voies aériennes humaines. J'ai ensuite construit un atlas des différents types cellulaires qui tapissent les voies respiratoires humaines saines, du nez jusqu’à la 12ième génération de bronches. Le profilage de 10 volontaires sains a généré un ensemble de données de 77 969 cellules, provenant de 35 emplacements distincts, qui comprend plus de 26 types cellulaires épithéliaux, immunitaires et mésenchymateuses. Cet atlas illustre l'hétérogénéité cellulaire présente dans les voies respiratoires. Son analyse révèle une différence d'expression des gènes entre le nez et les voies respiratoires pulmonaires que j’ai caractérisé dans les cellules suprabasales, sécrétrices et multiciliées. Mes travaux ont également permis d'améliorer la caractérisation de certaines populations de cellules rares, comme les cellules "hillock", déjà décrites chez la souris. En conclusion, mon travail contribue à une meilleure compréhension des dynamiques de différenciation et d'hétérogénéité cellulaire dans les voies respiratoires humaines saines. La ressource ainsi constituée sera extrêmement utile dans tout projet futur visant à analyser avec précision les conditions spécifiques des maladies respiratoires.Improvements made in nucleic acid sequencing and cell handling technologies now offer the opportunity to analyze simultaneously the content of numerous single cells (RNA, DNA, ...) by global and unbiased approaches. This single-cell ‘omics’ revolution provides a new framework to revisit the “Cell Theory”, elaborated over several centuries, and essentially based on morphological and functional features. The many cell modalities now accessible at single- cell level, such as their transcriptome, spatial localization, developmental trajectories, enrich considerably this definition, and set a renewed context to precisely reassess the definition of ‘cell types’, ‘cell states’ as well as their different interactions and fates.My thesis work initially set up ad hoc approaches and statistical framework to analyze appropriately these single-cell data, which deeply differ from standard bulk RNA-seq. High variance, presence of a huge percentage of null values, large volume of data are among the specific characteristics of these datasets. My work was centered on the main experimental model of my host laboratory, e.g. the human airway epithelium. Human airways are lined by a pseudostratified epithelium mainly composed of basal, secretory, goblet and multiciliated cells. Airways also constitute a true cellular ecosystem, in which the epithelial layer interacts closely with immune and mesenchymal cells. This coordination between cells ensures proper defense of the respiratory system and its correct regeneration in case of external aggression and injuries. A better understanding of the operating sequences in normal and physiopathological situations is relevant in pathologies such as chronic obstructive pulmonary disease, asthma or cystic fibrosis.First, I characterized at a single cell level the precise and cell-specific sequence of events leading to functional regeneration of the epithelium, using a 3D model of human cells. I then built a single-cell atlas of the different cell types that are lining healthy human airways from the nose to the 12th generation of bronchi.By applying computational and statistical approaches, I have identified cell lineage hierarchies and was able to reconstruct a comprehensive cell trajectory roadmap in human airways. I not only confirmed previously described cell lineages, but I have also discovered a novel trajectory that links goblet cells to multiciliated cells, identifying novel cell populations and molecular interactors involved in the process of healthy human airway epithelium regeneration. The profiling of 12 healthy volunteers then generated a dataset of 77,969 cells, derived from 35 distinct locations. The resulting atlas is composed of more than 26 epithelial, immune and stromal cell types demonstrating the cellular heterogeneity present in the airways. Its analysis has revealed a strong proximo-distal gradient of expression in suprabasal, secretory, or multiciliated cells between the nose and lung airways. My work has also improved the characterization of rare cells, including “hillock” cells that have been previously described in mice.In conclusion, this work probably represents one of the first single-cell investigations in human airways. It brings original contributions to our understanding of differentiation’s dynamics and cellular heterogeneity in healthy human airways. The resulting resource will be extremely useful for any future single-cell investigators and also for establishing a very useful joint between clinical and biological works. As such, it will constitute a reference in any future project aiming to precisely analyze specific disease conditions