Is glycolysis a target to combat the malaria parasite? Evaluation of the effect of 2,3-disphosphoglycerate on parasite susceptibility

A malária é uma doença causada por um parasita unicelular do género Plasmodium, transmitido pela picada de um mosquito fêmea do género Anopheles. Ocorre principalmente em países com clima tropical e subtropical. Em 2017, foram diagnosticados cerca de 219 milhões de casos e 435 000 pessoas morreram devido à doença. A luta contra a malária é um desafio constante, principalmente devido ao rápido surgimento de resistências a novos fármacos, sendo a pesquisa de novos antimalários essencial para a sua eliminação. Existem factores genéticos do hospedeiro capazes de reduzir a susceptibilidade à doença. Como resultado da pressão selectiva exercida pela malária sobre o genoma humano, um em cada seis humanos no mundo é afectado por variantes nos eritrócitos que conferem alguma proteção contra a doença, como é o caso da drepanocitose ou anemia falciforme, talassemias e deficiências enzimáticas como glucose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD) e piruvato cinase (PK), entre outros. A compreensão dos mecanismos subjacentes a esta protecção poderá ajudar a encontrar novas ferramentas para lutar contra esta doença. No caso da deficiência em PK, as duas maiores anormalidades metabólicas são a baixa síntese de ATP e o aumento da concentração de 2,3-DPG. Esta tese tem como objetivo determinar o efeito do aumento de 2,3-DPG no desenvolvimento parasitário em culturas in vitro de dois clones de Plasmodium falciparum – sensível (3D7) e resistente (Dd2) à cloroquina, através de ensaios de suscetibilidade (IC50), invasão e maturação e do seu efeito na produção de ATP na glicólise de forma a perceber se o 2,3-DPG poderá ter potencial para ser transformado num agente antimalárico. Os resultados obtidos evidenciam diminuição do crescimento parasitário com o aumento da concentração do 2,3-DPG, tendo os valores de IC50 calculados às 24h, 48h e 72h variado entre 7.60 e 2,52 para a estirpe 3D7 e 8,18 e 2,34 para Dd2. Nos ensaios de invasão–maturação observou-se uma redução dos níveis de invasão dos eritrócitos na presença de 2,3-DPG quando comparados com o controlo (sem o metabolito).Malaria is a disease caused by an unicellular parasite of the genus Plasmodium, which is transmitted by the bite of female mosquito of the Anopheles genus. It occurs primarily in countries with tropical and subtropical climate and in 2017, around 219 million cases were reported and 435 000 people died due to the disease. The fight against malaria is a constant challenge, mainly due to the rapid emergence of resistance to new drugs, making the research of new antimalarials essential for its elimination. Some host genetic factors are able to reduce the susceptibility to the disease. As a result of selective pressure exerted by malaria on the human genome, one in six people are affected by erythrocyte variants that confer some protection against the disease, such as sickle-cell anaemia, thalassemia and enzyme deficiencies such as glucose-6-phosphate-dehydrogenase (G6PD) and pyruvate kinase (PK), among others. Understanding the mechanisms underlying this protection may help finding new tools to fight this disease. In PK deficiency case, the two major metabolic abnormalities are low ATP synthesis and increased 2,3-DPG concentration. This thesis aims to determine the effect of 2,3-DPG increase on parasite development in in vitro cultures of two Plasmodium falciparum strains – chloroquine-sensitive (3D7) and chloroquine-resistance (Dd2), through susceptibility assays (IC50), invasion and maturation assays and its effect on ATP production. Ultimately, on the long run, this may help to understand whether the increase of the intermediary human metabolite 2,3-DPG could be a potential antimalarial agent. The results obtained show a decrease in parasitic growth with increasing concentration of 2,3-DPG, with IC50 values at 24, 48 and 72 hours ranging from 7.60 to 2.52 for 3D7 and 8.18 to 2.34 for Dd2. The invasion and maturation assays revealed a reduction in the invasion levels of erythrocytes in the presence of 2,3-DPG compared to the control (without the metabolite)