Desenvolvimento de ferramentas de genômica funcional para implementação de estratégias em larga escala em Trypanosoma cruzi

Orientador: Prof. Dr. Wanderson Duarte Darocha.Coorientador: Prof. Dr. Christian Macagnan Probst.Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 26/03/2019.Inclui referências: p. 100-104.Resumo: Trypanosoma cruzi é um protozoário com um ciclo de vida complexo, que envolve hospedeiros invertebrados e vertebrados, incluindo o humano, onde o parasito pode causar a doença de Chagas. As formas de tratamento desta doença são incipientes e com efeitos colaterais severos. Apesar de vários genes já terem sido associados a resistência, abordagens globais baseadas em manipulação da expressão gênica foram muito pouco exploradas. Este parasito tem um grande repertório de genes, muitos de função desconhecida, para se adaptar aos mais diferentes ambientes, multiplicar, infectar, e etc. Esta carência de informação pode ser explicada em parte, até poucos anos atrás, pela inexistência de ferramentas para explorar função gênica em larga escala, ou pela escassez dos métodos convencionais de genômica funcional. Esse cenário nos propulsiona a desenvolver/adaptar metodologias de genômica funcional, e otimizar método de transfecção, que permitam contribuir ao entendimento da biologia celular deste organismo. Neste trabalho objetivou-se desenvolver e otimizar ferramentas de genômica funcional. No capítulo I, será descrito a otimização das condições de eletroporação de formas epimastigotas do T. cruzi, na forma de artigo publicado intitulado "Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection". Neste subprojeto foi possível aumentar as eficiências de transfecção transiente em aproximadamente 3 vezes comparando-se com métodos convencionais de eletroporação, além de proporcionar alta taxa de viabilidade dos parasitos (>90%). No capítulo II descrevese o desenho e construção de bibliotecas funcionais de Open Reading Frames (ORFs) e sua avaliação funcional em um protocolo de seleção de genes que em superexpressão estariam associados a resistência ao benzonidazol. Nessa abordagem preliminar foi possível identificar e validar uma ORF de Dm28c que codifica a proteína RNP-U2 como envolvida direta ou indiretamente no mecanismo de resistência à droga. Uma vez que no capítulo anterior foram geradas bibliotecas de superexpressão constitutiva que apresentam aparentemente baixa representatividade, decidimos no capítulo III desenvolver uma ferramenta baseada em recombinação para controle da expressão de forma eficiente em T. cruzi que também poderá ser aplicada para integração de sequências no genoma. Duas abordagens foram testadas, o sistema Cre-DOG e o sistema CREditing, e apresentadas na forma de artigo (submetido). Dos dois sistemas testados apenas CREditing se mostou bastante eficiente. No sistema CREditing, a CRE recombinase fusionada a NLS de T. cruzi é obtida na forma recombinante purificada e é introduzida em formas epimastigotas por eletroporação. Este sistema foi capaz de ativar ou reprimir a expressão de genes repórteres ou de genes associados ao metabolismo do benzonidazol pela inversão de sequência. CREditing também permitiu deletar segmentos genômicos integrados em lócus endógenos do parasito e superexpressar genes apenas em formas presentes no hospedeiro mamífero. Em conclusão, mostrou-se que o protocolo de eletroporação otimizado descrito no capítulo I permitiu melhorar a transferência de DNA plasmidial para formas replicativas do parasito, e mostramos que essas melhoras permitiram a transferência eficiente de bibliotecas de Open Reading Frames em formas epimastigotas de T. cruzi, levando à identificação de algumas ORFs associadas à resistência ao benzonidazol, como foi mostrado no Capítulo II. Esses protocolos permitirão em um futuro desenvolver estudos de genômica funcional em larga escala em T. cruzi, um protozoário difícil de manipular por técnicas convencionais.Abstract: Trypanosoma cruzi is a protozoan with complex lifecycle, involving vertebrate and invertebrate hosts, including humans, causing Chagas disease. The drug treatment of this disease is incipient and with severe side effects. Although several genes have been associated with drug resistance, global approaches based on manipulation of gene expression are poorly explored. This parasite has a large repertoire of genes, many of them with unknown function, to adapt to different environments, multiply, infect, and so on. This lack of information can be partially explained by the lack of tools to exploit gene function on a large scale, or by the scarcity of conventional methods of functional genomics, until few years ago. This scenario prompt us to develop/adapt methodologies to do functional genomics, and to optimize transfection method, allowing to understand the cellular biology of this organism. In Chapter I, the optimization of the electroporation conditions of T. cruzi epimastigotes forms that will be presented as a published paper entitled "Effective gene delivery to Trypanosoma cruzi epimastigotes through nucleofection". At this point, it was possible to increase 3x transient electroporation efficiency compared to conventional electroporation methods, in addition to providing high parasite viability (> 90%). In Chapter II we describe the design and construction of functional library of T. cruzi Dm28c Open Reading Frames (ORFs) and its functional evaluation using a protocol to identify genes whose overexpression would be associated with benznidazole resistance. In this preliminary approach, it was possible to identify and validate a Dm28c ORF that encodes the RNP-U2 protein as directly or indirectly involved in drug resistance mechanism. Due to the apparent low representativeness of ORFs from the constitutive overexpression library, we decided to develop a recombination-based tool for efficient gene expression control in T. cruzi that could also be applied for genome sequence integration (Chapter III). Two approaches were tested, the Cre-DOG system and the CREditing system, and the data were presented in the form of a submitted manuscript. Only CREditing presented reliable results presenting very good recombination efficiency. In the CREditing system, CRE recombinase fused to a T. cruzi H2B nuclear localizing signal (NLS) was obtained in the purified recombinant form and it was introduced into epimastigote forms by electroporation. This system was able to activate or repress the expression of reporter genes or genes associated with benzonidazole metabolism. CREediting also allowed to delete genomic segments integrated into the endogenous locus of the parasite, and also to overexpress genes in tissue culture derived trypomastigotes. In conclusion, it was shown that the optimized electroporation protocol described in chapter I allowed to improve the transfer of plasmid DNA to replicative forms of the parasite. Using the optimized electroporation protocol, functional genomics library for ORF overexpression were introduced into T. cruzi epimastigotes forms, leading to the identification of an ORF associated with resistance to benzonidazole (Chapter II). These protocols in combination with the recombination tool described in Chapter III will allow in a near future to develop large-scale functional genomics in T. cruzi, a protozoan difficult to manipulate by conventional techniques