Design, characterization and validation of integrated bioelectronics for cellular studies: from inkjet-printed sensors to organic actuators

Mención Internacional en el título de doctorAdvances in bioinspired and biomimetic electronics have enabled coupling engineering devices to biological systems with unprecedented integration levels. Major efforts, however, have been devoted to interface malleable electronic devices externally to the organs and tissues. A promising alternative is embedding electronics into living tissues/organs or, turning the concept inside out, lading electronic devices with soft living matters which may accomplish remote monitoring and control of tissue’s functions from within. This endeavor may unleash the ability to engineer “living electronics” for regenerative medicine and biomedical applications. In this context, it remains a challenge to insert electronic devices efficiently with living cells in a way that there are minimal adverse reactions in the biological host while the electronics maintaining the engineered functionalities. In addition, investigating in real-time and with minimal invasion the long-term responses of biological systems that are brought in contact with such bioelectronic devices is desirable. In this work we introduce the development (design, fabrication and characterization) and validation of sensors and actuators mechanically soft and compliant to cells able to properly operate embedded into a cell culture environment, specifically of a cell line of human epithelial keratinocytes. For the development of the sensors we propose moving from conventional microtechnology approaches to techniques compatible with bioprinting in a way to support the eventual fabrication of tissues and electronic sensors in a single hybrid plataform simultaneously. For the actuators we explore the use of electroactive, organic, printing-compatible polymers to induce cellular responses as a drug-free alternative to the classic chemical route in a way to gain eventual control of biological behaviors electronically. In particular, the presented work introduces inkjet-printed interdigitated electrodes to monitor label-freely and non-invasively cellular migration, proliferation and cell-sensor adhesions of epidermal cells (HaCaT cells) using impedance spectroscopy and the effects of (dynamic) mechanical stimulation on proliferation, migration and morphology of keratinocytes by varying the magnitude, frequency and duration of mechanical stimuli exploiting the developed biocompatible actuator. The results of this thesis contribute to the envision of three-dimensional laboratory-growth tissues with built-in electronics, paving exciting avenues towards the idea of living smart cyborg-skin substitutes.En los útimos años los avances en el desarrollo de dispositivos electrónicos diseñados imitando las propiedades de sistemas vivos han logrado acoplar sistemas electrónicos y órganos/tejidos biológicos con un nivel de integración sin precedentes. Convencionalmente, la forma en que estos sistemas bioelectrónicos son integrados con órganos o tejidos ha sido a través del contacto superficial entre ambos sistemas, es decir acoplando la electrónica externamente al tejido. Lamentablemente estas aproximaciones no contemplan escenarios donde ha habido una pérdida o daño del tejido con el cual interactuar, como es el caso de daños en la piel debido a quemaduras, úlceras u otras lesiones genéticas o producidas. Una alternativa prometedora para ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, y en particular para implantes de piel, es embeber la electrónica dentro del tejido, o presentado de otra manera, cargar el sistema electrónico con células vivas y tejidos fabricados por ingeniería de tejidos como parte innata del propio dispositivo. Este concepto permitiría no solo una monitorización remota y un control basado en señalizaciones eléctricas (sin químicos) de tejidos biológicos fabricados mediante técnicas de bioingeniería desde dentro del propio tejido, sino también la fabricación de una “electrónica viva”, biológica y eléctricamente funcional. En este contexto, es un desafío insertar de manera eficiente dispositivos electrónicos con células vivas sin desencadenar reacciones adversas en el sistema biológico receptor ni en el sistema electrónico diseñado. Además, es deseable monitorizar en tiempo real y de manera mínimamente invasiva las respuestas de dichos sistemas biológicos que se han añadido a tales dispositivos bioelectrónicos. En este trabajo presentamos el desarrollo (diseño, fabricación y caracterización) y validación de sensores y actuadores mecánicamente suaves y compatibles con células capaces de funcionar correctamente dentro de un entorno de cultivo celular, específicamente de una línea celular de células epiteliales humanas. Para el desarrollo de los sensores hemos propuesto utilizar técnicas compatibles con la bioimpresión, alejándonos de la micro fabricación tradicionalmente usada para la manufactura de sensores electrónicos, con el objetivo a largo plazo de promover la fabricación de los tejidos y los sensores electrónicos simultáneamente en un mismo sistema de impresión híbrido. Para el desarrollo de los actuadores hemos explorado el uso de polímeros electroactivos y compatibles con impresión y hemos investigado el efecto de estímulos mecánicos dinámicos en respuestas celulares con el objetivo a largo plazo de autoinducir comportamientos biológicos controlados de forma electrónica. En concreto, este trabajo presenta sensores basados en electrodos interdigitados impresos por inyección de tinta para monitorear la migración celular, proliferación y adhesiones célula-sustrato de una línea celular de células epiteliales humanas (HaCaT) en tiempo real y de manera no invasiva mediante espectroscopía de impedancia. Por otro lado, este trabajo presenta actuadores biocompatibles basados en el polímero piezoeléctrico fluoruro de poli vinilideno y ha investigado los efectos de estimular mecánicamente células epiteliales en relación con la proliferación, migración y morfología celular mediante variaciones dinámicas de la magnitud, frecuencia y duración de estímulos mecánicos explotando el actuador biocompatible propuesto. Ambos sistemas presentados como resultado de esta tesis doctoral contribuyen al desarrollo de tejidos 3D con electrónica incorporada, promoviendo una investigación hacia la fabricación de sustitutos equivalentes de piel mitad orgánica mitad electrónica como tejidos funcionales biónicos inteligentes.The main works presented in this thesis have been conducted in the facilities of the Universidad Carlos III de Madrid with support from the program Formación del Profesorado Universitario FPU015/06208 granted by Spanish Ministry of Education, Culture and Sports. Some of the work has been also developed in the facilities of the Fraunhofer-Institut für Zuverlässigkeit und Mikrointegration (IZM) and University of Applied Sciences (HTW) in Berlin, under the supervision of Prof. Dr. Ing. H-D. Ngo during a research visit funded by the Mobility Fellows Program by the Spanish Ministry of Education, Culture, and Sports. This work has been developed in the framework of the projects BIOPIELTEC-CM (P2018/BAA-4480), funded by Comunidad de Madrid, and PARAQUA (TEC2017-86271-R) funded by Ministerio de Ciencia e Innovación.Programa de Doctorado en Ingeniería Eléctrica, Electrónica y Automática por la Universidad Carlos III de MadridPresidente: José Antonio García Souto.- Secretario: Carlos Elvira Pujalte.- Vocal: María Dimak