Acute and long-term effects of early life inflammatory pain on brain morphometry and adult behaviour

Premature infants receive numerous painful procedures while in the neonatal intensive care unit (NICU). Pain may lead to long-term negative consequences that include cognitive, social, and learning deficits and a higher incidence of depression. The mechanisms by which pain can exert these effects are currently unclear. To examine more precisely the effect of neonatal pain on brain morphology and adult behaviour, a rat model of acute neonatal inflammatory pain was used to mimic pain experienced by preterm infants in the NICU. Male rat pups were injected with either a low formalin dose (0.75%-1.5%), saline (0.9%), or remained uninjected during the first 2 weeks of life. First, we performed magnetic resonance imaging (MRI) on postnatal days (PND) 15 and 35 to identify potential changes in brain volume in response to pain. In a second study, we examined cellular proliferation (using Ki67, an endogenous marker of cell proliferation) and neurogenesis (using survival of BrdU-labelled cells) in response to pain in regions identified from our MRI analysis. Neurons were also counted using NeuN (a marker of mature neurons). Our final study investigated changes in anxiety and fear related behaviours in adult offspring subjected to pain as neonates. We consistently found that neonatal pain causes moderate hypertrophy in the basolateral amygdala (BLA) in PND 15 pups. These volumetric changes were not observed on PND 35. Similarly, neuronal counts (NeuN) showed a moderate increase in the BLA of PND 15 pain-exposed pups compared to controls (p=0.062), however, this effect was not seen on PND 35. However, there was no significant treatment effect of pain on Ki67-positive cells on PND 15, suggesting that neuronal proliferation induced by early pain occurred prior to PND 15. In addition, pain had no effect on the number of NeuN and BrdU positive cells on PND 35, suggesting that pain has transient effects. In adulthood, rats that were exposed to pain as neonates did not differ from controls (either saline injected or uninjected) in behavioural tests measuring anxiety (social interaction and elevated plus maze) and fear (fear conditioning). Overall, these results show that repeated exposure to mild inflammatory pain during the neonatal period produces transient changes in BLA morphology, the consequences of which do not affect adult behaviours mediated by this structure. The early transient hypertrophic response to pain in the BLA may trigger plastic changes sufficient to protect the animal from any potentially negative functional consequences. Keywords: pain, neonate, amygdala, anxiety, fear, proliferation, survival, neuronLors de leur séjour dans l'unité des soins intensifs, les bébés prématurés sont soumis a de nombreuses procédures douloureuses qui ne sont pas toujours bien contrôlées et qui ont des conséquences a long terme sur les fonctions cognitives, l'apprentissage et les interactions sociales. Les mécanismes qui sont impliqués sont encore peu connus. Au cours de ce travail, nous avons utilisé un modèle animal de douleur inflammatoire répétée au cours de la période néonatale chez le rat pour comprendre les effets à long terme sur la morphologie du cerveau et le comportement relié à l'anxiété à l'âge adulte. Nous avons injecté les pattes arrières des ratons entre le jour 3 et 14 de la vie postnatale avec soit de la saline (0.9%) ou de la formaline (0.75-1.5%) une fois par jour. Un groupe contrôle n'a pas été injecté. Dans une première étude, nous avons mesure les changements de volume du cerveau induits par la douleur au jour 15 et 35 de vie postnatale. À l'aide de la résonance magnétique (scanner de 7T), nous avons pu démontrer une augmentation presque significative du volume de l'amygdale basolatérale (BLA) chez les ratons de 15 jours soumis à la douleur compares aux contrôles injectes à la saline. Par contre, cette hypertrophie amygdalienne n'était que transitoire car les différences de volume avaient disparu au jour 35. En quantifiant le nombre de neurones matures (en immunohistochimie avec NeuN) dans la BLA à ces mêmes âges, nous avons pu confirmer que le l'exposition à la douleur durant le 2 premières semaines de vie produit une hypertrophie neuronale dans la BLA au jour 15 mais que celle-ci n'est plus observée après le sevrage au jour 35. Nous avons également déterminé que l'hypertrophie au jour 15 était probablement due a une prolifération cellulaire qui avait eu lieu avant cette période car le nombre de cellules avec un marquage positif pour le Ki-67 (un marqueur endogène de prolifération) était semblable entre les groupes douleur et contrôles au jour 15. De même, le nombre de cellules ayant incorpore le BrdU au jour 15 n'était pas différent au jour 35 selon les traitements. Ceci suggère également que l'effet de la douleur sur la morphologie de la BLA se limite à la période pendant laquelle les ratons sont soumis à la douleur. Finalement, à l'âge adulte, nous n'avons pas observé de différence significative entre les groupes contrôles et douleur en ce qui a trait à l'anxiété (par le test de interaction sociale et « elevated plus maze ») ou par rapport au conditionnement à l'anxiété (par le test de « fear conditioning »). Ces résultats nous permettent de conclure qu'une douleur de type inflammatoire modeste au cours des deux premières semaines de vie chez les ratons produit une hypertrophie neuronale transitoire de la BLA, une structure impliquée dans les émotions et les comportements relatifs à l'anxiété. Nous n'avons pas détecté de conséquences à long terme sur le morphologie neuronale ou les comportements d'anxiété suite a cette expérience néonatale