Regulation of mitochondrial DNA accumulation during oogenesis

Oocytes contain a large stock of mitochondria. These are essential because, following fertilization, the embryo does not resume mitochondrial DNA (mtDNA) replication until near the time of implantation; therefore, a large stock is essential to ensure that each blastomere inherits a sufficient number of mitochondria. However, the timing and control of mtDNA accumulation in oocytes are poorly understood. We have developed a PCR-based assay that enables the mtDNA content of individual mouse oocytes to be measured. We report that the quantity of mtDNA increases progressively during oocyte growth, reaching ~175,000 copies per cell. When oocytes reach full-size, however, mtDNA ceases to accumulate suggesting that accumulation of mtDNA is closely correlated with oocyte growth. To investigate the mechanism of accumulation, we analyzed mtDNA content in mouse oocytes grown in vitro. As in vivo, we found that mtDNA content increased during oocyte growth in vitro. Unexpectedly, although oocytes did not grow to the same size in vitro as in vivo, the mtDNA accumulated to the same extent under both conditions. This suggests that mtDNA accumulation is mechanistically uncoupled from oocyte growth. To test this, we incubated growing oocytes in the presence of LY294002, an inhibitor of phosphoinosotide-3 kinase, or in the absence of the surrounding granulosa cells. As expected, oocyte growth was inhibited under both conditions. In contrast, mtDNA accumulated in the oocytes despite the growth inhibition. These results indicate that the accumulation of mtDNA is independent of increase in size during oocyte growth. We then examined the expression of nuclear-encoded genes required for mtDNA replication. The amount of Tfam, Polga, and Polgb increased co-coordinately with oocyte growth. However, their quantity subsequently declined in fully grown oocytes. We propose that mtDNA ceases to accumulate in fully grown oocytes owing to the loss of the mRNAs encoding these essential components of the replication machinery. Thus, these mRNAs may be limiting factors that determine the rate and extent of mtDNA accumulation during oogenesis. We also evaluated the ATP content during oogenesis as a function of mtDNA activity. Growing oocytes showed a higher ATP content than fully grown oocytes and as oocytes developed toward meiotic maturation ATP level significantly decreased. These results suggest that growing oocytes may have increased energy needs than the subsequent developmental stages.Durant sa croissance, chaque ovocyte doit accumuler un grand nombre de mitochondries, essentielles pour le développement embryonnaire ultérieur. Après la fécondation, le stock de mitochondries ovocytaire doit être suffisant pour assurer les divisions successives de chaque blastomère de lèmbryon puisque que la reprise de la réplication de làDN mitochondrial (mtDN ne s`observe quàvant l`implantation. Les mécanismes régulant làccumulation de mtDNA durant la croissance ovocytaire et les étapes de celle-ci sont cependant encore mal connus. Dans ce travail, nous avons mis au point une technique PCR permettant de mesurer la quantité de mtDNA dans un seul ovocyte. Les résultats montrent que la quantité de mtDNA augmente progressivement pendant la croissance ovocytaire pour atteindre environ 175000 copies par cellule. Lorsque l`ovocyte atteint sa taille finale, làccumulation de mtDNA sàrrête, suggérant une corrélation entre la croissance et làccumulation de mtDNA. Nous avons ensuite vérifié cette hypothèse en mesurant la quantité de mtDNA pendant la croissance ovocytaire in vitro dans différentes conditions. De la même manière, nous avons observé une accumulation de mtDNA durant la croissance ovocytaire in vitro. Cependant, bien que la croissance ovocytaire soit moindre in vitro comparée à celle obtenue in vivo, la quantité de mtDNA accumulée est comparable dans les deux conditions. Lorsque les ovocytes sont mis en culture en présence dùn inhibiteur de la phosphoinosotide-3 kinase (LY294002), ou en làbsence de cellule de la granulosa, la croissance ovocytaire in vitro est inhibée mais làccumulation de mtDNA est maintenue. Ces résultats montrent que làccumulation de mtDNA est indépendante de la croissance ovocytaire. Nous avons ensuite analysé lèxpression des gènes nucléaires essentiels à la réplication de mtDNA. Lèxpression des ARNm de Tfam, Polga, et Polgb augmente parallèlement à la croissance ovocytaire mais diminue lorsque l`ovocyte a atteint sa taille finale. Ces résultats suggèrent que làrrêt de làccumulation de mtDNA en fin de croissance ovocytaire est liée à làrrêt de la transcription des gènes essentiels à sa réplication. La présence dàRNm de ces différents gènes pourraient être le facteur limitant la régulation de làccumulation de mtDNA dans l`ovocyte durant sa croissance. Nous avons également évalué la quantité dàTP dans les ovocytes. Les ovocytes en croissance sont plus riches en ATP que les ovocytes ayant atteints leur taille définitive et la quantité dàTP chute lors de la maturation méiotique de l`ovocyte. Ces résultats suggèrent que les ovocytes en croissance ont un besoin énergétique supérieur comparé á ceux á des stades ultérieurs