Synthesis and biological study of aminoglycoside derivatives to overcome bacterial resistance

Aminoglycosides are broad-spectrum antibiotics that target the A-site of bacterial 16S ribosomal RNA. Their use, however, is increasingly threatened by the rapid spread of resistance. One of the most common determinants of aminoglycoside resistance in bacteria is the expression of a class of enzymes known as aminoglycoside 6′-N-acetyltransferases (AAC(6′)s). These enzymes use acetylcoenzyme A (AcCoA) to acetylate most aminoglycosides at the 6′-NH2, thus decreasing their affinity for RNA and leading to bacterial resistance. One strategy pursued by the Auclair research group to overcome aminoglycoside resistance is to develop AAC(6′) inhibitors. Chapter 2 of this thesis describes enzymatic studies with the group's first generation of inhibitors, aminoglycoside-CoA bisubstrates and truncated analogs. The bisubstrates exhibited potent nanomolar competitive inhibition of the Enterococcus faecium isoform AAC(6′)-Ii and proved to be useful mechanistic and structural probes. They did not however show activity in cells. Enzymatic studies with truncated bisubstrates allowed extensive SAR studies and led to the discovery of a second generation of inhibitors, one of which is capable of blocking aminoglycoside resistance in cells expressing AAC(6′)-Ii. To improve the potency of this compound, a series of derivatives with various amide groups replacing the ester functionality were synthesized. It was hypothesized that this modification would increase potency and biological stability. To our surprise however these small changes had a negative impact on the interaction between the inhibitors and AAC(6′)-Ii. Chapter 3 describes our second approach to counter aminoglycoside resistance, which involved the synthesis of new aminoglycosides designed to be active against resistant bacterial strains. A series of neamine N-6′-acylated derivatives were designed to retain the hydrogen bonding ability of 6′-N to RNA, yet disrupt binding to AAC(6′)-Ii. Some of these compounds showed moderate but not clinically relevant activity in cells.Finally, the third approach elaborated in Chapter 4 is to design prodrugs with dual, resistance inhibition and antibacterial activities. The goal was to develop aminoglycoside N-6′ derivatives as prodrugs that were expected to be extended to bisubstrate analogs by the CoA biosynthetic enzymes in bacteria. The resulting bisubstrates were expected to not only block aminoglycoside resistance via AAC(6′) inhibition, but to also kill bacteria by blocking the fatty acid biosynthetic pathway. A small series of aminoglycoside derivatives was thus synthesized. Unexpectedly none of them showed direct antibacterial activity. Preliminary biological studies however suggest that even in the absence of in vitro AAC(6′) inhibition, these molecules can potentiate the activity of aminoglycosides against an aminoglycoside resistant strain. To our knowledge they are the first reported prodrugs able to block aminoglycoside resistance in cells.Les aminoglycosides sont des antibiotiques à large spectre qui ciblent le site A de l'ARN ribosomique 16S dans la bactérie. Leur usage, par contre, est de plus en plus menacé à cause de l'étendue rapide de la résistance contre les aminoglycosides. La classe d'enzyme aminoglycoside-6′-N-acétyltransférases (AAC(6′)) est l'un des détermiants de résistance le plus commun. Ces enzymes utilisent acétylcoenzyme A (AcCoA) pour acétyler plusieurs aminoglycosides à la position 6′-NH2, ce qui diminue leur affinité pour l'ARN et la résistance en résulte. Une des stratégies privilégiée par notre groupe de recherche pour combattre la résistance aux aminoglycosides est décrite au Chapître 2. Elle consiste à développer des inhibiteurs contre AAC(6′). La première génération d'inhibiteurs, des bisubstrats de type aminoglycoside-CoA, a démontré une inhibition compétitive nanomolaire in vitro. Quoiqu'ils fussent utiles comme éléments de recherche structurale et mechanistique, ils ne démontrent aucune activité biologique. L'étude subséquente d'analogues de bisubstrats raccourcis a permis d'établir des relations structure-activité et a mené à la découverte d'une seconde génération d'inhibiteurs, incluant une molécule avant la capacité de bloquer la résistance aux aminoglycosides dans les cellules bactériennes exprimant l'AAC(6′)-Ii. Pour améliorer l'efficacité de ce composé, nous avons synthétisé une troisième génération d'inhibiteurs dont l'ester a été remplacé par divers groupements amide. L'hypothèse était que l'amide serait plus stable, menant à des composés plus stables et plus efficace, biologiquement parlant. À notre surprise, ces modifications ont diminué de façon significative l'interaction entre les inhibiteurs et AAC(6′)-Ii. Le troisième chapître de cette thèse explore une autre stratégie pour contrer la résistance envers les aminoglycosides. Elle vise à créer des agents antibactériens actifs contre les bactéries résistantes. Une série de dérivés de néamine acylés à la position 6′-N ont été envisagés afin de retenir l'habileté de l'amine 6′ à faire un lien hydrogène avec l'ARN tout en perturbant l'adhérance envers l'AAC(6′). Certains composés ont démontré des propriétés antibactériennes modérées dans les cellules mais sans potentiel clinique. Enfin, notre troisième approche vise à créer des pro-médicaments possédant à la fois la capacité de contrer la résistance ainsi que des propriétés antibactériennes. Notre but était de développer des dérivés d'aminoglycoside qui seraient transformés en analogues de bisubstrats par les enzymes bactériennes impliquées dans la biosynthèse de CoA. Les bisubstrats résultant pourraient non seulement bloquer la résistance en inhibitant l'enzyme AAC(6′), mais aussi avoir des propriétés antibactériennes en affectant la biosynthèse des acides gras. Une série de ces dérivés d'aminoglycosides a été synthétisée et aucun produit ne montre d'activité antibacterienne. Par contre, des résultats préliminaires suggèrent que même si ces molecules n'inhibitent pas l'enzyme AAC(6') purifiée, elles possèdent l'habileté d'augmenter l'action des aminoglycosides dans les bactéries résistantes. Selon nos connaissances, il s'agit des premiers pro-médicaments capablent de bloquer la resistance aux aminoglycosides dans les cellules