RNAi applications: development of approaches for selection of siRNAs and characterization of miRNA function in cancer

RNA interference (RNAi) is an evolutionarily conserved me chanism for silencing gene expression mainly through small interfering RNAs (siRNAs) and microRNAs (miRNAs). SiRNAs have revolutionized experimental biology and gained recognition as a powerful tool for functional genomics studies. The sequence-specific selectivity and robust capacity of siRNA to inactivate genes in vivo has also led to the development of novel RNAi-based therapeutics. Recently, miRNA has attracted considerable attention due to its important roles in the regulation of various cellular processes, especially its link with cancer. Understanding of RNAi has advanced remarkably worldwide. In light of such progress, this project aimed to develop a high throughput approach for forward screening of the most effective siRNAs in mammalian cells, and to comprehensively analyze sequence variations in both miRNA targets and miRNA genes in human tumor tissues and characterize their roles in tumorigenesis. To develop a genetic forward approach for screening of siRNAs as the first objective, siRNA expression libraries were directly delivered into mammalian cells via bacterial invasion. The target genes were fused with the suicide gene, cytosine deaminase, and stably expressed in mammalian cells. The most effective siRNAs were conveniently and robustly identified in surviving cells under drug selection without the prior assay of the RNAi potency of individual siRNAs in all wells that is required by other siRNA screening methods. Significantly, the potent siRNAs isolated from the surviving cells proved to have noncellular toxicity. Hence, this approach can robustly enrich the most potent and nontoxic siRNAs in surviving cells, and thus has considerable potential to facilitate RNAi applications by minimizing the dose-dependent and sequence-nonspecific side effects of siRNAs. To investigate whether single-nucleotide polymorphisms (SNPs) located at miRNA-binding sites affect the expression of miRNA targetsRNA interférence (RNAi) est un mécanisme conservé au cours de l'évolution,les gènes de silence sont exprimés principalement par les petits RNAs interférents (siRNAs) et les microRNAs (miRNAs). Les petits RNAs interférents ont expérimentalement révolutionné la biologie, et ont obtenu la reconnaisance comme un outil puissant sur les études utiles génomiques. La sélectivité de la séquence spécifique et la capicité robuste de siRNA à inactiver les gènes in vivo a aussi dirigé le développement de la nouvelle thérapeutique de RNAi-based. Récemment, miRNA a attiré une attention considérable grâce à ses rôles importants dans la régulation de divers processus cellulaires, surtout ses liens avec le cancer. La compréhension de RNAi a progressé remarquablement dans le monde entire. À la lumière de tel progrès, ce projet s'est efforcé de développer une approche de haut rendement pour filtrer les siRNAs les plus effecaces dans les cellules mammifères, analyser d'une manière globale les variations des séquences dans les miRNAs de cibles et de gènes dans les tissus des tumeurs humains, et caractériser leurs rôles dans la cancérogénèse. Pour développer une approche génètique pour filtrer les siRNAs comme le premier objectif, les bibliothèques d'expression de siRNA ont été livrées directement aux cellules mammifères via les vecteurs bactériens. Les gènes de cibles ont été fondus avec le gène de suicide, et ont été exprimés avec stabilité dans les cellules mammifères. Les siRNAs les plus efficaces ont été identifiés commodément et puissamment dans la survie des cellules sous la sélection de médicament, sans l'essai préalable sur le pouvoir de RNAi de siRNAs individuel dans toutes les cellules qui sont demandées par les autres méthodes de filtrage de siRNA. Évidemment, les siRNAs puissants isolés de la survie des cellules prouvent qu'ils ont la toxicité non-cellulaire. De là, cette approche peut enrichir