Identification of the cellular and molecular mechanisms governing the post-translational regulation of the neuron- specific potassium/chloride cotransporter KCC2

The neuron-specific K+/Cl- cotransporter 2 (KCC2) is one of the major cation Cl- cotransporter (CCC) proteins in the central nervous system that controls Cl- homeostasis via mediating Cl- extrusion. KCC2 has been established as an essential protein in promoting the maturation of synaptic inhibition during development and controlling neuronal excitibility in the adult central nervous system (CNS). Although various mechanisms are known to regulate KCC2 gene expression, accumulating evidence has shown KCC2 activity can be altered on much shorter time scales in a manner of 10-20 minutes. This suggested post-translational mechanisms, which take place much more rapidly than gene expression, may also be an important means by which KCC2 function can be regulated. However, what these post-translational mechanisms are and how they contribute to the control of KCC2 function remain elusive. In this thesis, I set out to characterize the molecular mechanisms governing the post-translational regulation of KCC2, including its endocytosis, quaternary assembly, and cell surface expression. Specifically, my results suggest: 1) Endogenous KCC2 interacts with the clathrin-mediated endocytosis (CME) machinery; 2) KCC2 is constitutively endocytosed via a CME-dependent mechanism; 3) A di-leucine motif, 657LL658, is essential for both KCC2 constitutive endocytosis and the binding of KCC2 to the CME adaptor protein AP-2 complex; 4) Two regions within KCC2 proximal and central carboxyl terminus respectively mediate KCC2 dimerization, and in particular mutating the 657LL658 residues to alanines completely abolishes KCC2 dimerization; 5) The 657LL658 sequence is highly conserved amongst closely related K+/Cl- cotransporter proteins, but absent from the more distant Na+/Cl- cotransporters controlling Cl- uptake, suggesting an evolutionarily conserved mechanism may regulate the constitutive endocytosis and dimerization of functionally homologous KCC members; and 6) KCC2 expression at the neurLe co-transporteur d’ions K+ et Cl- (KCC2), spécifique aux neurones, est l’un des plus importants co-transporteurs de cations chlorure (CCC) du système nerveux central. Il contrôle l’homéostasie de la cellule en régulant l’extrusion d’ions chlorure. KCC2 est reconnu comme étant une protéine essentielle à la maturation de l’inhibition synaptique au cours du développement et au contrôle de l’excitabilité des neurones dans le système nerveux central de l’adulte. Bien que les mécanismes régulant l’expression de KCC2 soient connus, de nouvelles données suggèrent que l’activité de KCC2 peut aussi être modifiée sur de plus courtes périodes, de l’ordre de 10 à 20 minutes. Ceci suggère qu’un contrôle post-traductionnel, agissant beaucoup plus rapidement qu’un contrôle transcriptionnel, pourrait aussi être important dans la régulation de l’activité de KCC2. Toutefois, la nature de ces mécanismes post-traductionnels et la façon par laquelle ils contribuent à la fonction de KCC2 demeurent inconnus.Dans cette thèse, je vise à caractériser les mécanismes moléculaires qui gouvernent la régulation post-traductionnelle de KCC2, incluant son expression à la surface cellulaire, son endocytose et son assemblage quaternaire. Plus spécifiquement, mes résultats suggèrent que: 1) Le KCC2 endogène interagit avec la machinerie d’endocytose par clathrines (CME) ; 2) Le KCC2 est endocyté constitutivement par un mécanisme dépendant des clathrines; 3) Le motif di-leucine 657LL658 est essentiel non seulement à l’endocytose constitutive de KCC2, mais aussi à l’interaction entre KCC2 et le complexe protéique adaptateur AP-2; 4) Deux régions à l’intérieur de KCC2, l’une proximale et l’autre centrale à l’extrémité C-terminale, sont responsables de la dimérisation de KCC2 qui peut être abrogée par la substitution des leucine 657 et 658 par des alanines; 5) La séquence 657LL658 est très conservée pa