The identification of proteins interacting with the 53BP1 tandem Tudor domains

Tumor protein p53 binding protein 1 (53BP1) is a cell cycle checkpoint protein that is important in the early DNA double strand break (DSB) response signal pathway. Aberrant reduction or lack of 53BP1 is found in significant proportions of carcinomas. 53BP1 is recruited to DSB sites and forms foci through its tandem Tudor domain by recognizing dimethylated lysines in histones. The 53BP1 tandem Tudor (53BP1TT) domain consists of two tightly packed Tudor domains follow by a C-terminal alpha helix, and actively binds to methylated histone lysines H4K20 and H3K79. I hypothesized that 53BP1TT domain can potentially interact with non-histone targets, which contain methylated residues, and may be involved in the maintenance of genomic stability. The primary goal of the work presented in this thesis is to identify the proteins that interact with the 53BP1TT domain. I performed a proteomic screen by employing in vitro transcription/translation coupled reactions on pools of cDNA plasmids and identified two putative 53BP1TT targets, brahma-related gene 1 (BRG1), which is a chromatin remodeling catalytic subunit that has helicase and ATPase activities, and is thought to regulate transcription by altering the chromatin structure, and checkpoint kinase 1 (CHK1), which mediates DNA damage signal to downstream damage responsive proteins and initiates cell cycle checkpoint arrest. I demonstrated that both endogenous BRG1 and CHK1 interacted with the 53BP1TT domain in glutathione-S-transferase pulldown assays. Co-immunoprecipitation between ectopically expressed BRG1 and 53BP1 was observed. Interestingly, the interaction between endogenous BRG1 and 53BP1 was observed only after DNA damaLa protéine 53BP1 (p53 binding protein 1) (53BP1) est une protéine impliquée dans la surveillance du cycle cellulaire (checkpoint) activé par les brisures d'ADN double-brin (double-strand break ou DSB). L'absence ou la réduction d'expression de 53BP1 est une caractéristique retrouvée dans la majorité de carcinomes. 53BP1 est recrutée rapidement aux sites de DSB par ses domaines Tudor tandem qui reconnaissent les résidus de lysines dimethylées des histones. Les domaines 53BP1 Tudor tandem (53BP1TT) est comprennent deux domaines Tudor suivi par une hélice alpha au C-terminal et ces domaines ont une affinité spécifique pour les lysines methylées H4K20 et H3K79 des histones. Étant donné que les domaines Tudor tandem sont généralement caractérisés par leur interaction avec le des résidus methylés, j'ai émis l'hypothèse que les 53BP1TT pourraient d'interagir avec des protéines autres que les histones contenant des résidus methylés, ce qui révèlerait un rôle important dans le maintien de la stabilité génomique. Donc, le principal objectif du travail présenté dans cette thèse est l'identification de protéines interagissant avec 53BP1TT. Pour ce faire, j'ai employé la réaction couplée de transcription et traduction in vitro sur une banque d'ADNc. Ceci m'a permis d'identifier deux cibles putatives de 53BP1TT, soit CHK1 (checkpoint kinase 1) et BRG1 (brahma-related gene 1). Chk1 est connu de jouer un rôle clé dans la cascade de signalisation des brisures d'ADN double-brin et pour son interaction avec les homologues de levure de 53BP1, tandis que BRG1 est la sous-unité ATPase des complexes SWI/SNF impliques dans le remodelage de la chrom