Inactivation of the Integrin-Linked Kinase in osteoblasts increases mineralization

Signals from the extracellular matrix (ECM), mediated by integrins, play critical roles in regulating gene expression, differentiation, function, and survival of osteoblasts. Following engagement with the ECM, integrin receptors signal via multiple downstream effectors, including the Integrin-Linked Kinase (ILK). The net effect of stimulating the ILK signaling cascade is to modulate gene transcription: ILK-dependent phosphorylation of the cJun transcriptional coactivator, aNAC, induces the nuclear accumulation of the coactivator and potentiates c-Jun-dependent transcription. In order to determine the role of ILK in osteoblasts, we first inactivated ILK using RNA knockdown in osteoblastic cells. In parallel, we engineered mice with specific inactivation of ILK in osteoblasts and analyzed the phenotype of the mutant animals, as well as the behavior of primary cultures of ILK-deficient osteoblasts. MC3T3-E1 preosteoblasts were stably transfected with expression plasmid vectors encoding specific ILK siRNAs or a control, unrelated siRNA. Pools of cells stably transfected with each of the expression vectors were established and analyzed. ILK protein expression was efficiently inhibited in the ILK siRNA-transfected cells. Inhibition of Ilk expression led to cytoplasmic retention of aNAC and increased expression of the osteoblastic differentiation markers, collagen type I, bone sialoprotein, and osteocalcin. Strikingly, ILK-deficient osteoblasts showed dramatically increased mineralization. Mice with one inactivated ILK allele (ILK+/-) were mated with Col-I-Cre transgenic mice. Progeny from this cross (Col-I-Cre;ILK+/-) was bred to mice homozygous for a floxed ILK allele (ILKfl/fl) to yield mutant mice with ILK-deficient osteoblasts (CLes signaux de la matrice extracellulaire (ECM) qui sont transmis par les récepteurs intégrines sont essentiels pour contrôler l'expression génique, la différenciation, la fonction, et la viabilité des ostéoblastes. Suite à la liaison entre les intégrines et l'ECM, ces récepteurs transmettent leur signal via des messagers secondaires, incluant l'Integrin-Linked Kinase (ILK). La stimulation de ILK a comme effet de moduler l'expression génique : ILK est capable de phosphoryler le coactivateur transcriptionnel aNAC, ce qui induit la translocation nucléaire de ce dernier. Notre but était d'étudier le rôle de ILK dans les ostéoblastes. Premièrement, nous avons inhibé ILK en utilisant des ARN interférents dans les ostéoblastes MC3T3-E1. En parallèle, nous avons développé des souris déficientes en ILK dans les ostéoblastes seulement, et nous avons analysé le phénotype osseux ainsi que le comportement en cultures primaires des cellules ostéoblastiques déficientes en ILK. L'inhibition de ILK par interférence à l'ARN induit la rétention cytoplasmique d'aNAC, et augmente l'expression de marqueurs ostéoblastiques, tel le collagène de type I, la sialoprotéine de l'os, et l'ostéocalcine. De plus, nous avons mesuré une augmentation dramatique de la minéralisation. Des croisements précis ont permis de produire des souris dont un allèle de ILK est inactif dans tous les tissus, et l'autre allèle est inactif seulement dans les ostéoblastes (génotype : ColI-Cre; ILK-/fl). Les os ont été récoltés à plusieurs intervalles, et analysés par µCT et histomorphométrie. Les souris déficientes en ILK dans les ostéoblastes ne présentent aucun changement des paramètres histomorphométriques statiques ou