Nck1-dependent regulation of PERK activity impacts pancreatic β cell function and resilience

PKR-like endoplasmic reticulum (ER) kinase (PERK), an ER transmembrane Ser/Thr protein kinase, is part of the unfolded protein response (UPR) and a key regulator of pancreatic β cell function and homeostasis. PERK phosphorylates the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2) on its α subunit at Ser51 leading to attenuation of translation in stress conditions. Previously, we showed that the adaptor protein Nck1 modulates translation by directly interacting with the β subunit of eIF2 and assembling a phosphatase complex that dephosphorylates eIF2αSer51. In this thesis, we unveil the role of Nck1 in modulating PERK in pancreatic β cells. Using pancreatic mouse insulinoma MIN6 β cells stably expressing an Nck1-specific shRNA, we show that silencing Nck1 enhances PERK basal activity and signaling. We also show that Nck1, through its SH2 domain, directly binds PERK phosphorylated on Tyr561 (pY561) and thereby, limits PERK activity. In agreement with this concept, the activity of PERK Y561F, which escapes phosphorylation and Nck1 binding, was increased compared to wild-type PERK. Interestingly, Nck1 deficiency in MIN6 cells enhances insulin content in a PERK-dependent manner, by increasing insulin biosynthesis. In addition, Nck1-silenced MIN6 cells survive better to stress relevant to diabetes. Therefore, we hypothesized that PERK basal activity plays a role in determining β cell sensitivity to stress. Mechanistically, we provide evidence that silencing Nck1 in MIN6 cells enhances autophagy associated with PERK-induced sestrin2 and pAMPK signaling. Furthermore, we demonstrated that the PERK-Nrf2-dependent antioxidant response and the prosurvival Akt were constitutively activated in these cells. In conclusion, silencing Nck1 in pancreatic β cells enhances PERK basal activity, which in turn initiates signaling processes promoting a cellular adaptive response improving β cell function and resilience. Overall, my thesis provides insights on signaling pathways that enhance the robustness of pancreatic β cells, making them more efficient in producing insulin and more resistant to stresses related to diabetes.PKR-like ER kinase (PERK), une protéine kinase de type sér/thr exprimée à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), est une composante importante de la réponse au stress causé par l'accumulation de protéines mal conformées dans le RE, connue sous le nom de UPR (unfolded protein response). Plusieurs études ont démontré que PERK joue un rôle régulateur important dans la fonction et l'homéostasie des cellules β du pancréas. En condition de stress, PERK phosphoryle la sous-unité α du facteur d'initiation eIF2 sur la Ser51, ce qui réprime la traduction. Précédemment, nous avons montré que la protéine adaptatrice Nck1 module la traduction en interagissant directement avec la sous-unité β de eIF2 et en favorisant la formation d'un complexe incluant la phosphatase PP1 qui déphosphoryle eIF2αSer51. Dans cette thèse, nous dévoilons le rôle de Nck1 dans la modulation de l'activité de PERK dans les cellules β pancréatiques. En utilisant des cellules MIN6 dérivées d'un insulinome de souris, nous avons montré que l'expression stable d'un shRNA contre Nck1, qui diminue significativement l'expression de Nck1, augmente spontanément l'activité basale et la signalisation de PERK. Nous avons également découvert que Nck1 atténue l'activité de PERK en se liant directement par son domaine SH2 à la tyrosine Y561 phosphorylée de PERK. En accord avec ces résultats, nous avons montré qu'une mutation de PERK qui empêche sa phosphorylation sur Y561 (Y561F) et son interaction avec Nck1 augmente son activité. Par ailleurs, il est intéressant de noter que la diminution de l'expression de Nck1 dans les cellules MIN6 améliore leur contenu en insuline suivant l'augmentation de la biosynthèse d'insuline de manière PERK-dépendante. De plus, la déplétion de Nck1 permet aux cellules MIN6 de mieux survivre en condition de stress reliés au diabète. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que l'activité basale de PERK joue un rôle important dans la survie des cellules β face à un stress. En accord avec cette hypothèse, nous avons mis en évidence que la diminution des niveaux de Nck1 dans les cellules MIN6 augmente l'autophagie à travers l'induction de la protéine sestrin2 et l'activation de l'AMPK. De même, nous avons démontré que l'expression de gènes cytoprotecteurs contre le stress oxydatif par le facteur de transcription Nrf2 (dépendante de PERK) et la protéine kinase Akt sont activées de façon constitutive dans ces cellules. En conclusion, la diminution de Nck1 dans les cellules β pancréatiques augmente l'activité basale de PERK, qui à son tour déclenche des processus de signalisation aboutissant à une réponse adaptative cellulaire qui améliore la fonction et la survie des cellules β pancréatiques. Dans l'ensemble, ma thèse fournit de nouvelles informations sur les voies de signalisation qui contribuent à la robustesse des cellules β pancréatiques en améliorant la production d'insuline et la résistance aux stress associés au diabète