Molecular basis for the recruitment and function of DDX6 and GIGYF2 for post-transcriptional silencing by miRNAs

Dynamic and localized changes in the proteome are often engendered by post-transcriptional pathways which rapidly alter the rates of mRNA translation and degradation. Specifically, the microRNA (miRNA) class of non-coding RNAs silence target mRNA transcripts through sequential mRNA translation suppression and decay. Despite a deeper understanding of the manner by which miRNAs commit their targets to the 5’-3’ mRNA degradation pathway, the molecular basis for translation inhibition by miRNAs remains unclear. Here, we have endeavoured to identify microRNA-induced silencing complex (miRISC)-associated proteins that may impact mRNA translation, and assess the functional relevance of these proteins for miRNA function. First, we determine that the translation repressor and decapping activator, DDX6, interacts with the mammalian miRISC via binding to the CCR4-NOT deadenylase complex component, CNOT1. Disrupting complex formation affects miRISC-dependent gene silencing, thus revealing how DDX6 is recruited to, and important for, optimal miRISC activity. Moreover, we discover that the miRISC core protein, GW182, directly binds a component of a putative translation repressor complex, GIGYF2. Abrogating this interaction is accomplished through targeted mutation of conserved elements in both proteins, and establishes the groundwork for future functional studies of this complex for miRNA repression. Hence, factors recruited to miRISC are identified, and their potential contributions to miRNA-directed control of gene expression are elucidated.Des changements dynamiques et localisés du protéome sont souvent engendrés par des mécanismes post-transcriptionnels qui modifient rapidement les taux de traduction et de dégradation des ARNm. En particulier, les petits ARN non-codants de type microARN (miARN) inhibent l’expression de leur ARNm cibles en induisant de manière séquentielle la suppression de la traduction de ces ARNm, puis leur dégradation par la voie 5’-3’. Bien que le mécanisme de dégradation par les miARN soit bien compris, les bases moléculaires de l'inhibition traductionnelle de ces cibles restent encore inconnues. Nous avons donc cherché à identifier les protéines associées au complexe effecteur de l’activité des miARN (miRISC) qui sont responsables de la répression traductionnelle, et à confirmer la pertinence fonctionnelle de ces protéines pour l’activité des miARN. Nous avons ainsi déterminé que la protéine DDX6, un répresseur traductionnel et activateur du décoiffage des ARNm, interagit avec le complexe miRISC via sa liaison à la sous-unité CNOT1 du complexe de déadénylation CCR4-NOT. L’invalidation de l’interaction DDX6-CNOT1 perturbe la répression par le complexe miRISC, confirmant donc que DDX6 est indispensable à l'activité optimale de miRISC. De plus, nous avons découvert que la protéine centrale de miRISC, GW182, se lie directement à la protéine GIGYF2, un composant d'un complexe répresseur putatif de la traduction. Des expériences de mutagénèse dirigée visant les résidus conservés sont actuellement en cours afin d’inhiber l’interaction GW182-GIGYF2. Ces données permettront d’établir des bases expérimentales solides pour de futures études fonctionnelles du rôle de ce complexe dans la répression par les miRNA. Par conséquent, de nouveaux facteurs recrutés par le complexe miRISC ont été identifiés, et leurs contributions potentielles à la régulation de l’expression génique par les miARN sont désormais mieux comprises