Role of p45 NF-E2 and TXNIP in terminal erythroid differentiation

Red blood cell pathologies are among the most prevalent causes of mortality and morbidity worldwide, highlighting the need to gain more understanding of the normal erythropoiesis process and to find novel targets to efficiently modulate it. In particular, there are still many open questions with respect to the regulation of terminal erythroid differentiation, therefore we investigated the role of the proteins p45 NF E2 and TXNIP in this process.In vitro studies have demonstrated that absence of p45 NF E2 leads to abrogation of α- and β globin production, while its reintroduction rescues globin expression. In vivo, the majority of p45 NF E2 knockout mice die shortly after birth due to hemorrhage. Neonates display severe anemia, while surviving adults present splenomegaly, severe thrombocytopenia and mild erythroid abnormalities, namely reduced hemoglobin content per cell, reticulocytosis and hypochromia. We investigated the role of p45 NF E2 in terminal erythroid differentiation, since little is known about its function in red cells in vivo. We showed that deletion of p45 NF E2 affects the serum level of erythropoietin, which is upregulated by over two fold in knockout mice. Loss of p45 NF E2 was associated with an increase in splenic erythropoiesis, as evidenced by an accumulation of early precursors. These observations are consistent with a stress erythropoiesis phenotype. In the bone marrow, we observed a different distribution of precursor populations compared to wild type mice, suggesting a partial differentiation block. Therefore, the spleen is likely compensating for ineffective erythropoiesis in the bone marrow. Analysis of bone marrow samples revealed increased GATA1 levels in p45 NF E2-/- mice as well as an increased proportion of erythroid cells arrested at the G0/G1 stage of cell cycle. Those results are consistent with studies linking GATA-1 to cell cycle regulation and provide mechanistic insights into the role of p45 NF E2 in erythroid differentiation. TXNIP is a ubiquitous protein involved in various cellular processes including differentiation, growth, apoptosis and redox control. Knockout mice display a metabolic defect of impaired fatty acid utilization. With respect to hematopoiesis, TXNIP has been shown to play roles in natural killer cells and hematopoietic stem cells. Our results are the first that suggest a role for TXNIP in erythropoiesis. We observed a robust increase of TXNIP in mouse erythroleukemia (MEL) cells treated with DMSO or HMBA, known inducers of erythroid differentiation. This upregulation was present at the transcript and protein levels and detected early. The increase of TXNIP was not abrogated by the addition of the antioxidant N-acetylcysteine. The upregulation of TXNIP was confirmed in another model of erythroid differentiation, G1E ER cells, which undergo differentiation upon activation of the GATA1 transcription factor. In addition, we showed that TXNIP levels were induced following inhibition of the MAP kinases p38 or JNK, while blocking ERK1/2 did not have an effect on TXNIP. TXNIP is also linked to iron homeostasis, since we observed increased iron uptake and decreased transferrin receptor in an overexpressing clone. In vivo, our results with TXNIP-/- mice revealed a new phenotype of impaired splenic erythropoiesis with a partial block between basophilic and late basophilic/polychromatic erythroblasts. In summary, our data demonstrated that p45 NF E2 and TXNIP are both involved in the process of terminal differentiation of erythroid precursors.Les pathologies des globules rouges sont parmi les causes les plus prévalentes de mortalité et de morbidité, d’où la nécessité de comprendre mieux le processus d’érythropoïèse et de trouver de nouvelles cibles pour le moduler. Plusieurs questions demeurent en suspens quant à la régulation de la différentiation érythroïde terminale, de sorte que nous avons investigué le role des protéines p45 NF E2 et TXNIP dans ce processus.Des études in vitro ont démontré que l’absence de p45 NF E2 mène à l’abrogation des globines α et β, alors que son réintroduction permet de recouvrer leur expression. In vivo, la majorité des souris knockout pour p45 NF E2 meurent peu après la naissance suite à des hémorragies. Les nouveau-nés démontrent une anémie sévère, alors que les adultes survivants présentent une splénomégalie, une sévère thrombopénie ainsi que des anomalies légères des globules rouges, telles une concentration réduite d’hémoglobine par cellule, de la réticulocytose et de l’hypochromie. Nous avons étudié le role de p45 NF E2 dans la différentiation érythroïde terminale, car peu de choses sont connues quant à sa fonction in vivo. Nous avons montré que l’absence de p45 NF E2 affecte les niveaux d’érythropoïétine dans le sérum, qui se trouvent doublés dans les souris knockout. La perte de p45 NF E2 est associée à une augmentation de l’érythropoïèse dans la rate, comme démontré par une accumulation des précurseurs plus précoces. Ces observations dénotent un phénotype d’érythropoïèse de stress. Dans la moelle osseuse nous avons observé une distribution altérée des populations de précurseurs, comparé aux souris de type sauvage, suggérant un blocage partiel de la différentiation. Ainsi, la rate compense pour une érythropoïèse inefficace dans la moelle osseuse. L’analyse des échantillons de moelle osseuse a révélé une augmentation des niveaux de GATA1 chez les souris p45 NF E2-/-, ainsi qu’une proportion accrue des cellules arrêtées à l’étape G0/G1 du cycle cellulaire. Ces résultats sont consistants avec des études associant GATA1 à la régulation du cycle cellulaire et procurent un élément de mécanisme quant au role de p45 NF E2 dans la différentiation érythroïde.TXNIP est une protéine ubiquitaire impliquée dans plusieurs processus cellulaires, tels la différenciation, la croissance, l’apoptose et le contrôle redox. Les souris knockout présentent des défauts dans l’utilisation des acides gras. Par rapport à l’hématopoïèse, TXNIP a été démontré comme jouant un rôle dans les cellules tueuses naturelles et les cellules souches hématopoïétiques. Nos résultats sont les premiers à suggérer un rôle pour TXNIP dans l’érythropoïèse. Nous avons observé une augmentation robuste de TXNIP dans les cellules d’érythroleucémie murine traitées avec le DMSO ou le HMBA, des inducteurs connus de différentiation érythroïde. Cet accroissement au niveau des transcrits et de la protéine est observé tôt. L’augmentation de TXNIP n’est pas abrogée par l’ajout de l’antioxidant N-acétylcystéine. L’accroissement de TXNIP a été confirmé dans un second modèle de différentiation érythroïde, les cellules G1E-ER, qui se différencient suite à l’activation du facteur de transcription GATA1. De plus, nous avons montré que les niveaux de TXNIP sont induits suite à l’inactivation des MAP kinases p38 et JNK, alors que bloquer ERK1/2 n’a pas d’effet sur TXNIP. TXNIP est aussi lié à l’homéostasie du fer, puisque nous avons observé une augmentation de l’internalisation du fer et une diminution des niveaux du récepteur de transferrine dans un clone qui surexprime cette protéine. In vivo, nos résultats avec les souris TXNIP-/- révèlent un nouveau phénotype lié à l’érythropoïèse dans la rate, soit un blocage dans la transition entre les érythroblastes basophiles et les érythroblastes basophiles tardifs et polychromatiques. En résumé, nos données démontrent que p45 NF E2 et TXNIP sont tous deux impliqués dans la différentiation terminale des précurseurs érythroïdes