DNA synthesis in isolated nuclei from Hela cells.

DNA synthesis in isolated nuclei from Hela cells has been investigated. The cells were synchronized by selective detachment of mitotic cells from a growing mono layer. Only nuclei prepared from S phase were capable of DNA synthesis when incubated at 37°C in the presence of their cytoplasm and with a reaction mixture containing the four deoxynucleoside triphosphates, ATP and MgCl2. DNA synthesis in S phase nuclei was shown to be replication and not a repair type of synthesis. DNA synthesis in isolated S phase nuclei depended on the presence of S phase cytoplasm. G1 cytoplasm could not replace S phase cytoplasm, indicating that S phase cytoplasm contains a factor required for DNA synthesis. This factor appears to be a protein of a molecular weight greater than 10,000 daltons. Calf thymus DNA polymerases replace S phase cytoplasm. Partial purification of the cytoplasm from Hela cells was performed by Sepharose 6B gel chromatography. S phase cytoplasm was found to contain three separate peaks of DNA polymerase activity while G1 cells contained only one peak of this activity, corresponding to DNA polymerase A from S phase cells or calf thymus. Only fractions containing DNA polymerase activity could support nuclear DNA synthesis. DNA polymerase B but not A from either calf thymus or Hela cells could initiate DNA synthesis in G1 nuclei. The resultant DNA synthesis was not ATP dependent and continued linearly for at least 60 minutes.La synthèse du DNA dans les noyaux isolés de cellules Hela, préalablement synchronisées par la technique du détachement sélectif des cellules en mitoses, est étudiée. Il est trouvé que seuls les noyaux obtenus de cellules en phase S sont capables de synthétiser du DNA lorsqu'ils sont incubés à 37°C en présence de leur cytoplasme, de Déoxiribonucléos ide triphosphate. D'adénosine-triphosphate (ATP) et de chlorure de Magnésium. La synthèse de DNA observée dans les noyaux de cellules en phase S n'est pas dûe à un mécanisme de réparation mais est la conséquence d'une réplication. Cette synthèse de DNA dépend uniquement du cytoplasme des cellules en phase S puisque celui des cellules en phase Gl est sans effet. Ces résultats indiquent que le cytoplasme des cellules en phase S contient un ou plusieurs facteur(s) qui sont nécessaires à la synthèse du DNA dans les noyaux. Ce ou ces facteurs sont de nature protéique et d'un poids moléculaire supérieur à 10000 daltons. La DNA polymérase extraite de thymus de veau est capable de remplacer le cytoplasme de la phase S. Une purification partielle de celui -ci par chromatographie sur Sépharose 6 - B indique qu'il contient trois pics distincts (A, B, C) ayant une activité DNA-polymérasique. La purification du cytoplasme en phase G1 montre que celui-ci contient un seul pic d'activité DNA polymérasique correspondant à la DNA polymérase A obtenue du cytoplasme des cellules en phase S ou du thymus de veau. Seules les fractions contenant une activité DNA-polymérasique sont capables de supporter la synthèse du DNA dans les noyaux. La DNA polymérase B obtenue du thymus de veau ou du cytoplasme des cellules Hela en phase S est capable d'induire la synthèse du DNA dans les noyaux en phase G1 alors que la DNA polymérase A est sans effet. La synthèse du nouveau DNA n'est pas dépendante de l'ATP et continue de façon linéaire pour au moins 60 minutes