Induction of «in vitro» and «in vivo» steroidogenesis, through identifying and targeting the negative regulators of this process, 14-3-3y and E

Low circulating testosterone levels in the male are a major cause of hypogonadism and infertility and have been linked to mood changes, fatigue, osteoporosis, reduced bone-mass index and aging. The treatment of choice, testosterone-replacement therapy (TRT), reverses several symptoms of low testosterone levels. However, this treatment is linked to luteinizing hormone (LH) suppression, which leads to reduced fertility, increased risk for prostate cancer and cardiovascular diseases. Therefore alternate therapies with lower side effects are highly beneficial. The principal site of regulation of steroid hormone biosynthesis is the transfer of cholesterol from the outer to inner mitochondrial membrane (OMM and IMM, respectively). Hormonal stimulation of steroidogenic cells triggers the import of this lipophilic molecule into and accross OMM and inner membrane space (IMS) through a multi-protein complex, termed the transduceosome, at OMM. The transduceosome complex is assembled from cytosolic proteins such as the steroidogenic acute regulatory (STAR) protein and mitochondrial proteins such as translocator protein (TSPO) and voltage dependent anion channel 1 (VDAC1). The function of STAR, TSPO and VDAC1 has been an area of intense research during the last two decades. Nevertheless, and despite the progress made, the dynamics of physical and functional interactions between these proteins, required for the tight regulation of the rate of steroid formation is unknown. The lack of evidence for direct protein-protein interactions suggested a role for scaffold/adaptor protein(s). In silico analysis, indicated that STAR, TSPO and VDAC1 contain 14-3-3 binding motifs, and experimental data showed that the mitochondrial levels of 14-3-3ε and γ isoforms were increased in response to hormone treatment of Leydig cells, in a manner parallel to increased steroidogenesis. The 14-3-3 family of proteins is involved in the regulation of several intracellular signaling pathways, such as the integrity of the cytoskeleton, cell metabolism, signal transduction, protein trafficking, cell cycle and apoptosis. Despite the ubiquitous roles reported for some 14-3-3 isoforms throughout mammalian tissues, unique functions were also described for each one of the known 14-3-3 isoforms. These functions are proposed to be due to tissue-specific post translational modifications. We identified 14-3-3γ and ε as novel regulators of steroidogenesis, part of the transduceosome protein complex. 14-3-3γ and 14-3-3ε target the cytosolic STAR and mitochondrial VDAC1, respectively, and negatively regulate the rate of steroidogenesis. 14-3-3γ is hormonally induced, similarly to STAR, and functions transiently by blocking the phosphorylation dependent activation of STAR, only at the initiation of steroidogenesis. Therefore, we propose that the negative regulatory role of 14-3-3γ on STAR is the reason behind the 2 hrs delay in the induction of maximal steroid production seen in response to hormone treatment in MA-10 mouse tumor Leydig cells. Thereafter, 14-3-3ε is activated. As a scaffold protein, 14-3-3ε targets VDAC1 and intercalates between VDAC1 and TSPO at the OMM where it buffers the import of cholesterol into mitochondria through the TSPO-VDAC1 complex. To investigate the physiological significance of the 14-3-3ε-VDAC1-TSPO interaction in steroidogenesis, we developed a transducible fusion peptide that blocks the endogenous interactions between 14-3-3ε and VDAC1. This peptide was found to induce basal and cAMP-dependent steroidogenesis in MA-10 cells as well as testosterone formation in vitro, ex vivo and in vivo in adult rats. The in vivo induction was shown to be LH-independent. Due to the high sequence homology and similarities in the tertiary structures between the rat and human VDAC1 and 14-3-3ε proteins it is proposed that the developed peptide could serve as a lead molecule for the development of new means to treat diseases related to low testosterone production.Un faible taux de testostérone dans la circulation est une cause majeure d’hypogonadisme et d’infertilité chez l’homme, associé à des troubles de l’humeur, la fatigue, l’ostéoporose, une réduction de la masse osseuse et au vieillissement. La thérapie actuelle est la Thérapie de Remplacement de Testostérone (TRT). En dépit de la réduction des symptômes induite par la TRT, cette thérapie peut engendrer une augmentation du risque de cancer de la prostate, ainsi qu’une suppression de l'hormone lutéinisante (LH) responsable d’une réduction de la fertilité et des troubles cardiovasculaires. Par conséquent, le développement d’une thérapie alternative minimisant les effets secondaires, serait bénéfique. L’étape principale de la biosynthèse d’hormone stéroïde est le transport du cholestérol de la membrane mitochondriale externe vers la membrane mitochondriale interne (MME, MMI respectivement). La stimulation hormonale des cellules stéroïdogéniques induit le transport de cette molécule lipophilique à travers l’espace aqueux existant entre MME et MMI, par l’intermédiaire d’un complexe multi-protéique, le transduceosome situé au MME. Ce complexe est un ensemble de protéines cytosoliques comprenant la protéine STAR et des protéines mitochondriales telles que la TSPO et VDAC1.Ainsi que les fonctions de STAR, TSPO et VDAC1 dans ce complexe ont été largement étudiés, les dynamiques d’interactions physique et fonctionnelle inter-protéique,déterminant du taux de stéroïdogenèse, restent mal connues et suggère la présence de protéine adaptatrices. Les analyses in silico ont révélé la présence des motifs protéiques de type 14-3-3 sur STAR, TSPO et VDAC1, ainsi qu’une augmentation du taux de deux isoformes appartenant à la famille 14-3-3 au niveau mitochondriale durant la stéroïdogenèse. Les protéines de la famille 14-3-3 sont impliquées dans la régulation de divers processus cellulaires, tels que l’intégrité du cytosquelette, le métabolisme, la transduction de signaux cellulaires, la migration des protéines, le cycle cellulaire et l’apoptose. Parmi leurs fonctions ubiquitaires connues dans les tissus de mammifères, des fonctions uniques ont cependant été décrites pour chaque isoforme de cette famille 14-3-3. Ceci serait dû à l’existence de modifications post traductionnelles différentes. Nous avons déterminé que les protéines 14-3-3γ et ε sont de nouveaux régulateurs négatifs de la stéroïdogenèse. faisant partie du transduceosome. Les protéines 14-3-3γ et ε interagissent avec STAR et VDAC1 respectivement dans le cytoplasme et la mitochondrie et régulent négativement la stéroïdogenèse. La 14-3-3γ subit une stimulation hormonale, de façon identique à STAR, induisant une inactivation de cette protéine par l’inhibition de sa phosphorylation à l’initiation de la stéroïdogenèse. Ainsi la régulation négative de STAR par 14-3-3γ serait responsable du retard d’induction de 2 heures du maximum du taux de stéroïdogenèse observé après simulation. Par la suite, 14-3-3ε est activée. En tant que protéine d’échafaudage, la cible principale de 14-3-3ε est VDAC1, celle-ci peut s’intercaler entre la TSPO et VDAC1 à la MME. Par ce biais, 14-3-3ε contrôle le transport du cholestérol vers la mitochondrie par TSPO/VDAC1. Pour comprendre l’importance physiologique sur la stéroïdogenèse des interactions entre 14-3-3ε, VDAC1 et TSPO, nous avons développer des peptides de fusion portant un domaine de transduction qui traversent les membranes cellulaires et de bloquent les interactions entre 14-3-3ε et VDAC1. Ces peptides induisent la production de testostérone in vitro, ex vivo et in vivo chez le rat adulte. L’induction in vivo est spécifique aux testicules et indépendante de LH. 14-3-3ε et VDAC1 présentent une importante homologie de séquence ainsi que des structures tertiaires similaires entre rats et humains, par conséquent la modélisation in silico suggère que ces peptides peuvent aussi être utilisés pour le traitement de bas taux de testostérone chez l’homme