Structural and functional characterization of polysaccharide co-polymerases

Polysaccharide Co-Polymerases (PCPs) comprise a large superfamily of proteins and are found in both Gram-negative and Gram-positive species. Members of this protein superfamily are involved in the export of a diverse set of glycans found on the bacterial surfaces and can be recognized by a characteristic topology where a large periplasm-exposed domain is anchored to the inner membrane by two transmembrane helices. Many PCP family members modulate the complex glycan biogenesis by imposing a given number of the repeat units on the growing polysaсcharide chain and as such are often referred to as the chain-length regulator proteins. The molecular mechanism of how the chain-length regulation is accomplished by the PCP proteins has been intensely studied but still remains elusive. All PCP proteins studied to date are known to assemble into the homo-oligomeric complexes; however, the exact subunit composition of the chain-length regulator PCPs has been a subject of controversy. PCP proteins do not possess a well-defined catalytic active center nor do they contain a clear carbohydrate-binding pocket. I used a previously determined crystal structure of one of the family members to design a number of chimeric and mutant proteins and assessed their behaviour in vivo. This allowed me to map out functionally important regions, most of which were found on the surface of the oligomeric assemblies formed by these proteins. I crystallized several periplasmic domains of the mutant and chimeric proteins produced above as well as the wild-type periplasmic domain from another bacterium. This work further expanded the repertoire of high-resolution crystal structures available for this particular bacterial protein family. I also established that both chimeric and mutant proteins from various organisms exhibit a remarkably similar main chain conformation. I also showed that large periplasmic domains have the capacity to assemble in the oligomers of varying composition ranging from trimers to nonamers.To establish the native oligomerization state of select polysaсcharide-co-polymerases, I optimized the expression and purification conditions to obtain milligram quantities of the full-length membrane proteins suitable for structural studies. I analyzed one family member (wzzB) by electron microscopy using the single-particle analysis of the negatively-stained samples. I found the conditions, which lead to diffracting crystals for another full-length family member (wzzE), optimized them, and was able to solve the crystal-structure using the periplasmic domain as a search model to 6.0 Å resolution. Both family members were found to form octamers in the detergent solubilized form.Polysaccharide Co- polymérases (PCP) constituent une grande superfamille de protéines et se retrouvent dans les deux espèces à Gram positif et Gram négatif. Les membres de cette superfamille de protéines sont impliquées dans l'exportation d'un ensemble diversifié de glycanes trouvés sur les surfaces bactériennes et peuvent être reconnus par une topologie caractéristique où un grand domaine périplasme - exposée est ancrée à la membrane interne par les deux hélices transmembranaires. Beaucoup de membres de la famille de PCP moduler la biogenèse des glycanes complexes en imposant un nombre donné d' unités de répétition de la chaîne de polysaсcharide croissante et en tant que tel sont souvent désignés comme les protéines régulatrices de longueur de chaîne. Le mécanisme moléculaire de la façon dont la réglementation longueur de chaîne est réalisée par des protéines PCP a été intensément étudiée, mais jusqu'à ce jour reste insaisissable. Toutes les protéines PCP étudiés à ce jour sont connus pour monter dans les complexes homo- oligomères, mais la composition subunit exacte des médecins généralistes du régulateur de longueur de chaîne a été douteuse .Protéines PCP ne possèdent pas un centre actif catalytique bien défini ne contiennent jamais d'une poche de liaison de glucide clair. J'ai utilisé une structure cristalline déterminée auparavant de l'un des membres de la famille de concevoir un certain nombre de protéines chimériques et mutantes et évalué leur comportement in vivo. Cela m'a permis a identifier les régions fonctionnellement importantes, dont la plupart ont été trouvées sur la surface des ensembles oligomères formés par ces protéines.Je cristallisé plusieurs domaines périplasmiques des protéines mutantes et chimérique produits ci-dessus ainsi que le domaine périplasmique de type sauvage d'une autre bactérie. Ce travail a élargi le répertoire de structures cristallines haute résolution disponibles pour cette famille de protéines bactériennes particulier. J'ai aussi établi que les deux chimérique et les protéines mutantes de divers organismes présentent une conformation de la chaîne principale remarquablement similaires. J'ai aussi montré que les grands domaines périplasmiques ont la capacité de se rassembler dans les oligomères de composition allant de trimères à nonamères variable.Dans l'ordre, pour établir le véritable état d'oligomérisation de polysaсcharide -CO- polymérases certains, j'ai optimisé l'expression et les conditions de purification produisant milligrammes de protéines membranaires pleine longueur appropriées pour des études structurales . J'ai analysé un membre de la famille ( wzzB ) par microscopie électronique en utilisant l'analyse des échantillons négativement tachés à une particule . J'ai trouvé les conditions qui produisent les cristaux pour un autre membre de la famille sur toute la longueur (WzzE ), les a optimisés , et a été en mesure de résoudre la structure cristalline en utilisant le domaine périplasmique comme un modèle de recherche à la résolution 6.0A . Les deux membres de la famille ont été trouvés pour former octamères sous forme solubilisée de détergen