Combining calorimetry and NMR spectroscopy to study the interactions between a bisubstrate inhibitor and aminoglycoside N-6'-acetyltransferasae-li

Aminoglycoside 6'-N acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii) causes antibiotic resistance towards aminoglycosides (Amg), a class of clinically important antibiotics that is effective against Gram-positive and Gram-negative bacteria. This chromosomally-encoded homodimer from Enterococcus faecium catalyzes the transfer of an acetyl group from acetyl coenzyme A (AcCoA) to the 6' amine of most aminoglycosides. Such modification alters the binding affinity of Amg towards its ribosomal target in the bacteria, thereby diminishing its bactericidal activity. The Auclair lab has previously designed and synthesized a series of low nanomolar-affinity bisubstrate inhibitors by covalently linking aminoglycosides and AcCoA. We envisaged that a combined use with AAC(6')-Ii inhibitors will rescue the potency of Amg towards its bacterial target, hence maintaining the effectiveness of the current therapeutic regime.In light of advancements in the sensitivity and accuracy of biophysical tools such as isothermal titration calorimetry (ITC), nuclear magnetic resonance (NMR), and circular dichroiism (CD), this thesis demonstrates the combined use of these biophysical tools in studying the interactions between one such bisubstrate inhibitor and AAC(6')-Ii. Chapter 2 demonstrates the complimentary uses of ITC and NMR in evaluating the bisubstrate inhibitor design approach. On one hand, we observed that the bisubstrate binds much more tightly than does each substrate component and the strategy of linking the two moieties in the bisubstrate reduces entropic penalty of binding by 30%. On the other hand, it was discovered that sub-optimal geometry of linking the two moieties weakened the binding interactions between the bisubstrate and AAC(6')-Ii, causing the widely-dispersed structural differences in the bisubstrate-bound AAC(6')-Ii from the ternary complex (AAC(6')-Ii-AcCoA-Amg). Thermodynamically, the latter effect results in a less favourable binding enthalpy that offset gains in binding entropy; ultimately the overall gibbs free energy of bisubstrate binding binding is compromised , compared to that of the addition of the component parts (Amg and AcCoaA). Binding to AAC(6')-Ii was previously shown to adopt substrate-dependent allosteric mechanisms. The combined use of biophysical tools in Chapter 3 provided valuable insights on the origin of the binding cooperativity seen in AAC(6')-Ii. The data obtained through the joint analyses of ITC, CD and NMR demonstrated that the bisubstrate binding follows the same allosteric model as does the aminoglycoside. Furthermore pre-binding of aminoglycoside at the interface removes the subsequent AcCoA binding cooperativity previously observed in the formation of the binary complex (AAC(6')-AcCoA). Together, these results confirmed the role of the dimer interface in modulating allostery in AAC(6')-Ii. Overall, this work illustrates the usefulness of combining biophysical tools in the evaluation of the thermodynamic basis of the bisubstrate design strategy as well as the characterization of protein allostery as a potential drug target, two otherwise elusive problems in drug discovery.L'enzyme aminoglycoside 6'-N acetytransférase-Ii (AAC(6')-Ii) provoque la résistance aux aminoglycosides (Amg), une famille d'antibiotiques importante d'un point de vue de la clinique grâce à leur efficacité contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives. Cette protéine homodimérique d'Enterococcus faecium, catalyse le transfert d'un groupe acétyl provenant d'acétyl-coenzyme A (AcCoA) vers l'amine 6' de la plupart des aminoglycosides. Une telle modification affecte l'affinité de liaison de l'aminoglycoside pour sa cible ribosomale dans les bactéries ce qui diminue son activité bactéricide. Le laboratoire Auclair a déjà conçu et synthétisé une série d'inhibiteurs bisubstrats dont l'affinité est à l'échelle du nanomolaire en liant de façon covalente des aminoglycosides et CoA. Il a été envisagé qu'une utilisation combinée d'un tel inhibiteur d'AAC(6')-Ii pourrait rétablir l'activité de l'aminoglycoside envers sa cible bactérienne et ainsi, assurer le maintien de l'efficacité du régime thérapeutique actuel. À la lumière des améliorations de la sensibilité et de la précision des outils biophysiques comme la calorimétrie isotherme à titration (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et le dichroïsme circulaire (CD), cette thèse démontre l'utilisation combinée de ces outils dans l'étude des interactions entre un tel inhibiteur bisubstrat et l'AAC(6')-Ii.Le chapitre 2 montre les utilités complémentaires de l'ITC et de la RMN dans l'évaluation de la démarche de conception d'un inhibiteur bisubstrat. D'une part, nous avons observé que le bisubstrat se lie beaucoup plus étroitement à AAC(6')-Ii que les substrats individuels dont il est composé. De plus, cette stratégie dans laquelle les deux substrats de l'enzyme se voient liés dans une seule molecule, le bisubstrat, réduit la pénalité entropique de liaison de 30%. Aussi, il a été découvert qu'en raison d'une orientation de liaison sous-optimale des deux moitiés de la molécule, l'interaction entre le bisubstrat et AAC(6')-Ii était moindre que prévue, résultant en différences structurelles largement dispersées entre l'AAC(6')-Ii lié au bisubstrat par rapport au complexe ternaire (AAC(6')-Ii-AcCoA-Amg). Au plan thermodynamique, l'enthalpie de liaison se trouvait affectée négativement, un effet qui contrebalance essentiellement les gains entropiques. Donc, l'énergie libre de Gibbs totale de liaison du bisubstrat est compromise par rapport à celle de l'addition des composantes individuelles (Amg et AcCoA). Il a été démontré précédemment les interactions de AAC(6')-Ii avec des ligands s'effectue par l'entremise de mécanismes allostériques dépendants du substrat. L'utilisation combinée d'outils biophysiques dans le Chapitre 3 a fourni de précieuses indications sur l'origine de la coopérativité observée chez AAC(6')-Ii. Les données obtenues conjointement par ITC, CD et RMN ont montré que les interactions de l'AAC(6')-Ii avec le bisubstrat suit le même modèle allostérique qu'avec les aminoglycosides. En outre, la coopérativité de liaison d'AcCoA précédemment observé dans la formation du complexe binaire (AAC(6')-AcCoA) est supprimée suite à une pré-liaison de l'aminoglycoside, don't le site est situé à l'interface entre les 2 unités du dimère. Ensemble, ces résultats confirment le rôle de l'interface dans la modulation de l'allostérie chez d'AAC(6')-Ii. Dans l'ensemble, ce travail illustre l'utilité de combiner des outils biophysiques dans l'évaluation, sur le plan thermodynamique, de la stratégie de conception du bisubstrat ainsi que la caractérisation de l'allostérie en tant que cible thérapeutique potentielle, deux problèmes autrement insaisissables dans le processus de découverte de médicaments