The biochemical and genetic characterization of the TCA cycle in «Sinorhizobium meliloti»

In the symbiotic association between S. meliloti and its plant host, the nutrient exchange from plant to bacteroid is in the form of C4-dicarboxylic acids such as malate. These compounds directly enter the TCA cycle and the derived energy is used for the nitrogen-fixation process. Malate dehydrogenase (mdh), the two subunits of succinyl-CoA synthetase (sucCD), and two of the three subunits of 2-oxoglutarate dehydrogenase (sucAB) are encoded as an operon with the order mdh-sucCDAB. The expression of this operon is controlled by a single promoter found directly upstream of mdh. The transcrptional start site was mapped (a guanine residue at postion -63) and RT-PCR demonstrated that expression is as one polycistronic message in cells grown in LBmc. Transcriptional lacZ-gene fusions to mdh, sucD and sucA demonstrated that the mdh promoter is under catabolite control as evidenced by the change in ß-galactosidase expression depending on the carbon-source. Expression was highest with acetate followed closely by arabinose and glutamate but lowest with pyruvate as sole carbon-source. MDH was purified, N-terminal sequenced and kinetic assays were performed to determine Km, Vmax. A pH 10 was found to be the optimal for MDH. 2-oxoglutarate exhibited competitive inhibition on MDH. The annotated genome of S. meliloti contains two alleles (sucB), one chromosomal and one on megaplasmid pSymB, which putatively encode the E2 subunit of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Only the chromosomally-borne allele was found to be a functional sucB. Lastly, results of a study of the E3 subunits of pyruvate dehydrogenase, 2-oxoglutarate dehydrogenase and branched-chained keto-acid dehydrogenase were presented.Dans la relation symbiotique entre S. meliloti et la plante M. sativa, l'apport en nutriments de la plante vers les bacteroids se fait sous la forme d'acides C4-dicarboxiliques tel que le malate. Ces composés entrent directement dans le cycle de Krebs et l'énergie produite est utilisée pour la fixation d'azote. Malate déhydrogénase (mdh), les deux composantes de succinyl-CoA synthèse (sucCD), et deux des trois composantes de 2-oxoglutarate déhydrogénase (sucAB), sont inscrites en un opéron dans l'ordre qui suit ; mdh-sucCDAB. L'expression de cet opéron est contrôlée par un seul promoteur situé directement en amont de mdh. Le site de début de transcription a été identifié et RT-PCR a démontré la nature polycistronique de l'expression dans les cellules provenant de bactéries cultivées avec LBmc. Fusions transcriptionelles aux gene-lacZ de mdh, sucD et sucA ont été utilisées pour déterminer les niveaux relatifs d'expression dans des cultures provenant de médiums minimaux contenant des sources de carbone spécifiques. MDH a été purifié, le N-terminal séquencé, et des dosages cinétiques ont été performés pour déterminer Km, Vmax, le pH optimal, et l'effet des inhibiteurs allostériques. Le génome annoté de S. meliloti contient deux allèles qui encodent supposément les composantes E2 (sucB) de 2-oxoglutarate déhydrogénase. Un seul des allèles a démontré être une version fonctionnelle de sucB. Finalement, les résultats d'une étude sur les composantes E3 de pyruvate déhydrogénase, sur 2-oxoglutarate déhydrogénase et sur déhydrogénase de kéto-acide de chaines ramifiées seront présentés