Proteolytic processing of the cell adhesion molecule coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR)

The Coxsackievirus and Adenovirus Receptor (CAR) is a cell adhesion molecule involved in various functions including neuronal and heart development, contribution to epithelial cell tight junction integrity, and suppression of glioma migration and invasion. Proteolysis of cell adhesion molecules, and a wide variety of other proteins, serves as a mechanism for protein turnover and may also have consequences on cellular signaling. Proteolysis by metalloproteases such A Disintegrin and Metalloprotease (ADAM) family members results in ectodomain shedding of substrates, while the presenilin/gamma-secretase complex mediates regulated intramembrane proteolysis (RIP), releasing from the plasma membrane intracellular domain fragments which may enter the nucleus after RIP and affect gene expression. Preliminary data from our laboratory suggested that CAR ectodomain is shed and that the remnant fragment is RIPped. In this study, we identified ADAM10 as a sheddase of CAR using assays involving shRNA knockdown and rescue, overexpression of wild-type ADAM10 and inhibition of ADAM10 activity by addition of its prodomain. In vitro peptide cleavage and mass spectrometry analyses suggested the involvement of CAR amino acids 224-227 in its ectodomain shedding. Ectodomain shedding is a prerequisite for RIP of CAR, and free CAR intracellular domain enters the nucleus. Modulation of ectodomain shedding did not affect CAR's inhibitory function in glioma migration. Furthermore, free CAR intracellular domain cannot inhibit glioma cell migration, suggesting that proteolysis of CAR ultimately abolishes this function and promotes tumorigenesis. On the other hand, in developing neurons, metalloprotease activity is required for CAR-mediated neurite outgrowth. Thus, CAR belongs to an increasing list of cell surface molecules that undergo ectodomain shedding and gamma-secretase-mediated RIP, and these proteolytic events can have a consequence on CAR function.Le récepteur de Coxsackievirus et d'Adenovirus (CAR) est une molécule d'adhésion qui est impliquée en plusieurs fonctions telles que le développement neuronal et cardiaque, la formation des jonctions serrées, ainsi que la suppression de l'invasion et de la migration de certaines cellules tumorales. La protéolyse des molécules d'adhésion cellulaire, ainsi que d'autres protéines de la membrane plasmique peut servir comme mécanisme de renouvellement et aussi peut avoir des conséquences sur la signalisation cellulaire. La protéolyse effectuée par les métallo-protéases, par exemple les membres de la famille « A Disintegrin and Metalloprotease » (ADAM), génère un fragment soluble du domaine extracellulaire du substrat, tandis que le complexe préséniline/gamma-sécrétase libère un fragment intracellulaire du domaine cytoplasmique (par un processus nommé RIP) qui peux être transporté au noyau et qui peux ainsi affecter l'expression génique. Les données préliminaires de notre laboratoire suggèrent que le domaine extracellulaire de CAR est clivé, et le fragment qui en provient subit le processus RIP. Durant ces travaux, nous avons identifié ADAM10 comme étant la protéine qui clivait CAR, basé sur plusieurs approaches expérimentales dont l'utilisation des shRNA contre ADAM10 , l'inhibition de son activité enzymatique et son surexpression. Le clivage peptidique in vitro et l'analyse spectrométrique de masse suggèrent que les acides aminés 224-227 de CAR sont impliqués dans le clivage du domaine extracellulaire. Ce clivage est obligatoire pour que CAR subisse le processus RIP, afin que le domaine intracellulaire de CAR puisse entrer dans le noyau. Le clivage du domaine extracellulaire de CAR n'a pas de conséquence sur l'effet inhibiteur de CAR sur la migration des cellules de gliome. En plus, le domaine intracellulaire de CAR libéré à la suite du processus RIP, n'inhibe non plus la migration des cellules de gliome, ce qui suggère que la protéolyse de CAR bloque cette fonction anti-tumorale de la protéine. Par contre, durant le développement neuronal, l'activité des métallo-protéases est nécessaire pour l'effet de CAR sur l'extension des neurites. En conclusion, CAR appartient au groupe de protéines membranaires qui sont clivés par les métallo-protéases ainsi que la préséniline/gamma sécrétase. Ce phénomène a des conséquences sur la fonction de CAR