Investigation of a hyaluronic acid-gelatin crosslinked microgel-hydrogel extracellular matrix for superficial lamina propria restoration in scarred vocal folds

Voice problems often involve physical injury and they have serious emotional, functional and economic consequences. The present research project contributes to the development of an injectable biomaterial for potential use in treating vocal fold (VF) lamina propria (LP) scarring disorder. A new biomimetic hydrogel system, based on hyaluronic acid (HA) and gelatin (Ge), with hierarchical structural organization was designed, characterized, and evaluated in vitro and in vivo. This hierarchical composite hydrogel was constituted from hybrid HA–Ge microgels, fabricated through water-in-oil mini-emulsification polymerization, embedded in a secondary HA network. Experiments were performed to investigate the suitability of such hierarchical network for VFLP tissue engineering. Scanning electron microscopy confirmed the spherical topography of the microgels. Scanning confocal microscopy of the microgels, with fluorescently stained gelatin molecules, indicated that gelatin molecules distribute evenly inside and on the HA–Ge microgels. The Young's modulus of the HA–Ge microgels was 22±2.5 kPa. The overall shear elastic modulus was 75±15 Pa at the frequency of 1 Hz. The viscoelastic properties of the biomaterial were in the range of the viscoelastic properties of human VFLP. The finding of in vitro studies using human VF fibroblast cells confirmed that the composite hydrogels benefits from high cell mobility in the external network and controlled cell adhesion by localized dense microgels. Cytotoxicity tests verified the viability of microgels as the cell substrate medium. Particles with submicrometer diameter were more effective than the larger microgels in establishing cellular adhesion and spreading. Crosslinking of the particles to the external network significantly improved the functionality of the particles as cell substrate medium. The material showed promise for the tissue engineering of VFLP. The composite injectable material was injected into rat vocal fold five days after full LP stripping. Microgels did not induce any immune response from the host. Methods were established using atomic force microscope to measure the elastic properties of the VFLP across different length scales to potentially use in the evaluation of the functionality of the tissue engineered LP constructs. The measured elasticity of rat VF tissue was two orders of magnitude greater than that of human VF tissue. The elastic modulus increased during the remodeling phase after full LP stripping in rat model. The elastic properties of the VF collagen fibrils, the main constituent of VF scar tissue, were measured to be approximately 1 MPa, three orders of magnitude greater than bulk elastic properties of VF tissue.Les troubles de la voix impliquent souvent des blessures physiques et elles ont de graves conséquences émotionnelles, fonctionnelles et économiques. Le présent projet de recherche contribue à l'élaboration d'un biomatériau injectable pour une utilisation potentielle dans le traitement des cicatrices des cordes vocales (VF) lamina propria (LP). Un système de nouvel hydrogel biomimétique, basé sur l'acide hyaluronique (HA) et de la gélatine (Ge), avec une organisation structurelle hiérarchique a été conçu, caractérisé et évalué in vitro et in vivo. Cet hydrogel hiérarchique composite a été constitué de Ge-HA hybride microgels, fabriqué par mini-émulsion de polymérisation de l'eau-dans-l'huile, et intégré dans un réseau secondaire HA.Des expériences ont été réalisées pour étudier l'adéquation du réseau hiérarchique pour l'ingénierie tissulaire VFLP. La microscopie électronique à balayage a confirmé la topographie sphérique des microgels. La microscopie confocale à balayage des microgels, avec fluorescence tachées des molécules de gélatine, a indiqué que les molécules de gélatine distribuaient uniformément à l'intérieur et sur les microgels HA-Ge. Le module de Young de HA-Ge microgels a été mesurée 22 ± 2,5 kPa en utilisant des tests d'indentation. L'ensemble de module d'élasticité en cisaillement a été mesuré 75 ± 15 Pa à la fréquence de 1 Hz. Les propriétés viscoélastiques du biomatériau étaient dans la fourchette basse des propriétés viscoélastiques de VFLP humaine. La constatation d'études in vitro, en utilisant des cellules de fibroblastes humains VF, a confirmé que les composites d'hydrogels bénéficient de la mobilité élevée des cellules dans le réseau externe et de l'adhésion contrôlée des cellules par les microgels denses localisés. Les tests de cytotoxicité a vérifié la viabilité de microgels pour un support substrat cellulaire. Les particules avec un diamètre submicrométrique étaient plus efficaces que les grands microgels en terme de l'adhérence cellulaire et la propagation. La réticulation des particules sur le réseau externe a amélioré de manière significative la fonctionnalité des particules en milieu substrat cellulaire. Le matériau a démontré de la promesse pour le génie tissulaire de VFLP et peut être également utilisé pour d'autres tissus mous. Le matériau composite injectable a été injecté dans les cordes vocales des rats cinq jours après le décapage complet de LP. Microgels n'a pas induit de réponse immunitaire de l'hôte.Des méthodes ont été établies à l'aide de microscope à force atomique pour mesurer les propriétés élastiques de la VFLP à travers différentes échelles de longueur pour éventuellement utiliser dans l'évaluation de la fonctionnalité de l'ingénierie tissulaire de LP construits. L'élasticité mesurée du VF de tissu de rat est de deux ordres de grandeur supérieure à celle du VF de tissu humain. Le module d'élasticité a augmenté pendant la phase de remodelage après le décapage complet de LP dans le modèle de rat. Les propriétés élastiques des fibrilles de collagène VF, le principal constituant du tissu cicatriciel du VF, ont été mesurées à environ 1 MPa, trois ordres de grandeur plus grand que les propriétés élastiques en vrac des tissus VF