Characterization of two novel cysteine proteases in the free-living organism «Macrostomum ligano »

The objective of this study was to explore Macrostomum lignano, a free-living organism, as a model organism for parasitic trematodes, such as Fasciola and Schistosoma, in order to better understand the role of their cysteine proteases (cathepsins). Using a bioinformatics approach, two novel cysteine proteases genes (mlcl1 and mlcb2) were identified and phylogenetically characterized. These genes were synthesized, cloned into the yeast secretory system Pichia pastoris (Invitrogen), and functionally-active recombinant proteins were expressed and purified. These recombinant peptidases were then characterized biochemically in terms of activity and stability in various conditions including temperature, salinity and pH. Antibodies specific for the recombinant proteins were generated through a peptide or whole-protein immunization, and tested against both the recombinant proteins and the worm extract proving that the proteins exist in the worm. These studies lay the foundation for further investigations on the biological function of the cysteine peptidases using RNAi and confocal microscopy. In conclusion, M. lignano is a tractable model organism for its parasitic counterparts.L'objectif de cette recherche était d'explorer l'organisme, vivant en liberté dans la nature, Macrostomum lignano en tant qu'organisme modèle pour ses cousins parasites, Fasciola et Schistosoma, et de mieux comprendre le rôle de leurs protéases cystéines (cathepsins). En utilisant une approche bioinformatique, deux nouveaux gènes de protéases cystéines (mlcl1 et mlcb2) ont été découverts et caractérisés phylogénétiquement. Ces gènes ont été synthétisés, clonés dans un système de sécrétion employant la levure Pichia pastoris (Invitrogen) et exprimés en tant que protéases recombinantes et actives. Ces protéases recombinantes ont alors été caractérisées biochimiquement en termes d'activité et de stabilité dans diverses conditions telles que la température, la salinité et le pH. Des anticorps spécifiques aux protéines recombinantes ont été générés en immunisant des mammifères avec des séquences de peptides ou la protéine recombinante entière, et ont été testés avec l'extrait du vers prouvant ainsi que les protéines sont bel et bien exprimées. Ces études jettent la base pour l'investigation sur la fonction biologique des protéases cystéines par l'emploi du RNAi et de la microscopie confocale. En conclusion, M. lignano est un organisme modèle tractable pour ses cousins parasites