Structural and functional characterization of Argonaute MID domains

Small RNAs associate with Argonaute (AGO) proteins and guide them to their target nucleic acids via sequence specific interactions. Most small RNAs are formed from a double-stranded precursor. It is critical that the correct strand of this duplex is chosen and associates with an appropriate AGO protein. These processes are referred to as 'strand selection' and 'small RNA sorting' (or 'Argonaute sorting') and they are strongly influenced by the identity of the nucleotide found at the small RNA 5' end. The AGO MID domain, which is the site of interaction with the 5' nucleotide, was proposed to have evolved to preferentially bind certain 5' nucleotides and discriminate others. Therefore, the MID domains are believed to direct small RNA sorting and strand selection via specific interactions with the 5' nucleotide.I have solved the crystal structures of the MID domain from human AGO2 (hAGO2) in complex with nucleoside monophosphates (NMPs), which mimic the 5' nucleotide. The structures identified specific contacts between a rigid loop in the protein, which we termed the 'nucleotide specificity loop', and the nucleotide base of U or A, but not C or G. Dissociation constants from NMR titration experiments are in agreement with the crystal structures and this bias we observed in the hAGO2 MID domain reflects the distribution of nucleotides at the 5' end of miRNAs, which are the main binding partners for this AGO protein. I then characterized nucleotide-specific interactions in the MID domains of Arabidopsis thaliana (at)AGO1, atAGO2, and atAGO5. NMR titration experiments confirmed that these proteins display a bias towards U, A, and C, respectively. Furthermore, crystal structures revealed that the nucleotide specificity loop adopts strikingly different conformations in each of these MID domains. Structures of the atAGO1 MID domain in complex with NMPs revealed the structural basis for specificity of interaction with U or C and not A or G. A number of studies had implicated the MID domain of hAGO2 in miRNA-mediated translational repression via direct interactions with the mRNA 5' cap structure. Using cap-analogues I demonstrated that the interaction is non-specific and not physiologically relevant since it is located in the 5' nucleotide binding site.Les petits ARNs s'associent aux protéines de la famille des Argonautes (AGO) et les guident vers les acides nucléiques ciblés par l'appariement de leurs séquences. La plupart des petits ARNs sont formés à partir d'ARN précurseurs à double brins. Il est critique que le bon brin de ce duplex soit choisi et qu'il s'associe à l'AGO approprié. Ces processus sont appelés 'sélection du brin' et 'triage du petit ARNs' (ou 'triage par l'Argonaute') et sont fortement influencés par l'identité du nucléotide se trouvant à l'extrémité 5' du petit ARN. Le domaine MID de l'AGO, étant le site de liaison avec le nucléotide 5', a été proposé d'avoir évolué afin d'interagir préférablement avec certains nucléotides 5' et de discriminer les autres. Ainsi, on croit que les domaines MID dirigent la sélection du brin et le triage du petit ARN en faisant appel à des interactions spécifiques avec le nucléotide 5'. J'ai résolu les structures cristallines du domaine MID de l'AGO2 humain (hAGO2) en complex avec des nucléosides monophosphates (NMPs), ces derniers imitant le nucléotide 5'. Les structures cristallines ont permis d'identifier des contacts spécifiques entre une boucle rigide de la protéine, appelée la 'boucle de spécificité au nucléotide', et la base des nucléotides U or A, mais pas C ou G. Les constantes de dissociation obtenues par des expériences de titration par RNM sont en accord avec les structures cristallines et la préférence observée chez le domaine MID d'hAGO2 reflète la distribution des nucléotides à l'extrémité 5' des micro (mi)ARNs, qui sont les principaux partenaires de liaison de cette protéine AGO. J'ai ensuite caractérisé les interactions spécifiques au nucléotide des domaines MID d'Arabidopsis thaliana (at)AGO1, atAGO2, et atAGO5. Des expériences de titration par RNM ont confirmé que ces protéines montrent une préférence pour U, A, et C, respectivement. De plus, les structures cristallines ont révélé que les boucles de spécificité au nucléotide adoptent des conformations considérablement différentes dans chacun de ces domaines MID. Les structures du domaine MID d'atAGO1 en complexe avec des NMPs ont révélé le fondement structural de la spécificité de l'interaction avec U ou C, et non A et G.Nombre d'études ont mêlé le domaine MID d'hAGO2 à la répression traductionnelle entremise par les miARNs par des interactions directes avec la coiffe à l'extrémité 5' de l'ARN messager. Par l'utilisation d'analogues de la coiffe, j'ai démontré que l'interaction est non-spécifique et n'est pas physiologiquement pertinente car elle est localisée dans le site de liaison avec le nucléotide 5'