The investigation of growth-arrest-specific 2 protein functions in cell division and its cytoskeleton binding mechanisms

The eukaryotic cell cytoskeleton plays many important roles in cells and their coordination is crucial for these important biological processes. Their functions are partially achieved by the actin-microtubule (MT) cross-linking proteins. Growth-arrest-specific (Gas) 2 was originally identified in murine fibroblasts under growth-arrest conditions. Gas2 protein contains putative actin- and MT-binding domains, which makes it a strong candidate to be an actin-MT cross-linking protein. However, the mechanisms of Gas2 cytoskeleton binding and its roles in cell division are still unclear. This thesis is focused on these questions. In Chapter 2, we have determined the Gas2 protein functions in Xenopus laevis embryo cell division and oocyte wound healing process. We have found that the full-length (FL) Gas2 protein and its MT-binding Gas2 domain, but not the actin-binding calponin homology (CH) domain, inhibit cell division and result in multinucleated cells. The observation that Gas2 domain alone can arrest cell division suggests that FL-Gas2 function is mediated by binding MTs. To investigate the mechanism of Gas2-induced cell division arrest, we have used a wound-induced contractile array assay and showed that FL-Gas2 stabilizes MTs. In Chapter 3, we have further investigated the FL-Gas2 protein cytoskeleton binding mechanisms in HeLa cells. The Gas2 domain itself significantly changes MTs morphology into a long loop-like bundled network. The FL-Gas2 facilitates MT polymerization and changes the dynamic behaviors of MTs. There are three protein kinase C (PKC) phosphorylation sites in the FL-Gas2 protein, and phosphomimetic point mutations reveal that all three are involved in the FL-Gas2 protein functional changes. Size-exclusive chromatography finally reveals that the FL-Gas2 protein forms a dynamic complex, which presumably has an important role in its cytoskeleton binding properties. Taken together, our data suggest that the non-phosphorylated FL-Gas2 protein forms a dynamic complex to bundle MTs, but its ability to cross-link F-actin and MTs is achieved by the phosphorylated FL-Gas2 protein. We propose that Gas2 function is mediated by binding and bundling MTs, leading to cell division arrest.Le cytosquelette participe à de nombreuses fonctions dans les cellules eucaryotes et sa bonne coordination est essentielle au bon fonctionnement de ces fonctions biologiques. Ces fonctions sont partiellement accomplies grâce aux protéines de liaisons des filaments actine-microtubule (MT). La protéine Gowth-arrest-specific (Gas) 2 a été originellement identifiée dans des fibroblastes murins en arrêt de croissance. Le fait que la protéine Gas2 contienne des domaines putatifs d'intéractions avec actine et les microtubules supporte l'hypothèse qu'elle agit comme protéine de liaison des filaments actine-microtubule. Cependant, les mécanismes que Gas2 utilise pour interagir avec le cytosquelette et participer à la division cellulaire ne sont pas connus. Cette thèse répond à ces questions.Dans le deuxième chapitre, nous avons démontré que la protéine Gas2 participe à la division cellulaire de l'embryon et à la cicatrisation de la plaie de l'ovocyte chez le Xenopus laevis. Nous avons trouvé que la protéine entière (FL) Gas2 et son domaine d'intéraction avec les microtubules, mais pas son domaine d'intéraction avec actine homologue a calponine (CH), inhibent la division cellulaire et résultent en la formation de cellules multinucléées. Nous déduisons du fait que le domaine de Gas2 puisse causer un arrêt de la division cellulaire à lui seul que la protéine entière FL-Gas2 fonctionne grâce à l'intéraction avec les microtubules. Pour étudier comment Gas2 induit l'arrêt de la division cellulaire, nous avons utilisé un essai d'induction de contraction par cicatrisation et démontré que FL-Gas2 stabilise les microtubules. Dans le troisième chapitre, nous avons étudié en détails comment la protéine FL-Gas2 interagit avec le cytosquelette dans les cellules HeLa. Le domaine de Gas2 change dramatiquement la morphologie des microtubules, celles-ci forme un réseau de boucles longues et regroupées. La protéine FL-Gas2 favorise la polymérisation des microtubules et change leur comportement dynamique. Il existe trois sites de phosphorylation par la protéine kinase C (PKC) dans FL-Gas2. Des points de mutations imitant la phosphorylation de ces trois sites ont démontré que les trois sites participent aux changements de fonctionnalité de FL-Gas2. La chromatographie par exclusion de taille a démontré que FL-Gas2 forme un complexe dynamique qui doit jouer un rôle important dans l'intéraction de la protéine avec le cytosquelette.En conclusion, nos résultats suggèrent que la protéine FL-Gas2 non-phosphorylée forme un complexe pour regrouper les microtubules, et qu'elle crée une liaison entre F-actine et les microtubules lorsqu'elle est phosphorylée. Nous formulons hypothèse que Gas2 agit en intéragissant et en regroupant les microtubules ce qui cause un arrêt de la division cellulaire