Quantitative fluorescence methods for studying cellular protein networks, with applications to the yeast galactose pathway

Biology in the past two decades has shifted away from qualitative observation towards quantitative data, and away from reductionism towards viewing the phenomena under study as systems. Developments in fluorescent reporters, experimental instrumentation, and computational power have been integral to this change. A key feature of this transformation has been a substantial increase in the use of mathematical models to explore and verify our understanding of complicated biological mechanisms. This thesis looks at three different aspects of the systems modelling approach: data acquisition, model creation and evaluation, and measurement of parameter values. The system under study for the first two parts is the GAL pathway of the yeast Saccharomyces cerevisiae, a well-known model for genetic regulation. Despite this pathway being relative simple and well studied, various questions remain about the details of its regulatory mechanism. In the first part, I describe methodology for acquiring dynamic protein expression data. I use the green fluorescent protein (GFP) as a reporter and make measurements from cell populations growing in a microplate reader. Of particular interest is a technique I introduce for removing the autofluorescence that contaminates the GFP fluorescence signal. My technique makes it possible to detect expression even from very weakly expressed proteins. In the second part, I have developed a basic, deterministic model of the GAL pathway, which I then fit to dynamic protein expression data. I use the model to demonstrate that based on available data, the current understanding of the GAL pathway does capture a wide range of GAL system behaviours. I also identify and explore the GAL network's sensitivity to the relative levels of inducer and repressor proteins and discuss future directions for experiments and model development. In the third part, I present theoretical work that addresses the challenge of measuring protein-protein interactions in vivo from Förster resonance energy transfer (FRET) fluorescence data. I designed a computational tool that uses a Bayesian statistical framework to infer the dissociation constant and FRET efficiency from FRET data. One key advantage of this approach is that it produces probability distributions for these parameters of interest, revealing the uncertainty in the estimates obtained. I also demonstrate the experimental conditions, such as variations in levels of FRET donors and acceptors, that are necessary for the inference of the dissociation constant and FRET efficiency to be possible.Au cours des deux dernières décennies, la biologie est passée d'une science réductionniste fondée sur l'observation qualitative à une science quantitative traitant les phénomènes biologiques comme des systèmes. Le développement de gènes rapporteurs fluorescents, d'instruments expérimentaux sophistiqués et de la puissance de calcul des ordinateurs ont été des éléments garants de cette transformation. Plus particulièrement, un élément clé de cette transformation a été l'utilisation croissante de modèles mathématiques pour explorer et vérifier notre compréhension de mécanismes biologiques complexes. Cette thèse traite de trois aspects de la modélisation des systèmes: l'acquisition de données, la création et l'évaluation d'un modèle et la mesure des valeurs de ses paramètres.Le système étudié dans les deux premières parties de cette thèse est la voie métabolique du galactose (GAL) chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Cette voie est un exemple bien connu de régulation génétique. Bien qu'elle soit relativement simple et déjà bien étudiée, plusieurs questions subsistent quant aux détails reliés à son mécanisme de régulation. Dans la première partie, je décris la méthodologie pour l'acquisition de données dynamiques d'expression de protéines. J'utilise la protéine fluorescente verte (GFP) comme rapporteur et effectue des mesures sur des populations de cellules croissant dans un lecteur de microplaques. Notamment, je présente une technique permettant d'éliminer l'autofluorescence qui contamine le signal de fluorescence de la GFP. Cette technique permet même la détection de l'expression de protéines très faiblement exprimées. Dans la deuxième partie, je développe un modèle déterministe de base de la voie GAL, que je raccorde par la suite à des données dynamiques d'expression de protéines. J'utilise ce modèle pour démontrer qu'en se basant sur les données disponibles la compréhension théorique actuelle de la voie GAL capture une grande partie des comportements réels du système. Je discute aussi de possibilités pour l'élaboration subséquente du modèle. Dans la troisième partie, je présente un travail théorique qui traite de la difficulté de mesurer in vivo les interactions entre protéines à partir de données fluorescentes résultant du transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET). Je conçois un outil de calcul qui utilise les statistiques bayésiennes pour déduire la constante de dissociation et l'efficacité du FRET de données FRET. Un avantage clé de cette approche est qu'elle produit des distributions de probabilité pour ces paramètres d'intérêt, révélant l'incertitude des estimations obtenues. Je démontre aussi les conditions expérimentales, telles que les variations dans les concentrations de donneurs et d'accepteurs du FRET, requises pour permettre l'inférence de la constante de dissociation et de l'efficacité du FRET