Dual agonist-antagonist functions of FTY720 influence neuroinflammation-relevant responses in human astrocytes

Astrocytes are the most abundant glia in the central nervous system (CNS), classically identified by their high expression of the intermediate filament, glial fibrillary acidic protein (GFAP). Astrocytes participate in a number of biochemical events important for CNS functions and play a dynamic role in regulating CNS injury/repair processes. In chronic inflammatory conditions such as multiple sclerosis (MS), astrocytes undergo pathophysiological changes that lead to a feature termed astrogliosis (Liberto, Albrecht et al. 2004; Sidoryk-Wegrzynowicz, Wegrzynowicz et al. 2011). Astrogliosis is common to MS lesions, and a novel therapeutic agent for MS, FTY720 (fingolimod, Gilenya™) demonstrates neuroprotective potential by inhibiting astrogliosis development (Choi, Gardell et al. 2011). FTY720 is an oral therapy recently approved for the treatment of MS, and is shown to readily access the CNS. There, it binds directly to sphingosine-1-phosphate receptors (S1PR) on astrocytes and the dynamics of S1PR signaling is shown to modulate astrocytic cellular responses that closely relate to MS pathology. This thesis examines the signaling and functional effects of FTY720 on primary human astrocytes. We used astrocytes derived from the human fetal CNS to explore neuroinflammation-relevant responses mediated by chronic (repeated daily) FTY720 administrations. FTY720 is known to initially acts as an agonist, activating S1PRs but also functions as an antagonist by promoting S1PR internalization and degradation; we examined whether these effects occurred in tandem. We report that receptors internalized by FTY720 can persist and continue to signal for an extended time period (hours). A single addition of FTY720 desensitizes the extracellular receptor-regulated phosphorylation (pERK) signaling response for >24 hours. Such refractory period for pERK signal transduction was maintained in astrocytes treated repeatedly (daily) with FTY720, otherwise the return of pERK activation was achieved by 72 hours following initial treatment. Moreover, receptor desensitization patterns correlated with the loss of proliferative responses induced by the natural ligand sphingosine-1-phosphate (S1P). We show that even under the condition of receptor desensitization (repeated daily administrations) FTY720 attenuated the capacity of the pro-inflammatory cytokine IL-1β, to activate calcium sensitive pathways. Repeated FTY720 treatments did not inhibit serum-induced pERK responses or the secretions of IL-6 and IP-10 in response to IL-1β activation. Our results indicate that daily FTY720 exposures can be a relevant regulator of neuro-inflammation by acting as a functional antagonist for external stimuli (natural ligand S1P) while sustaining internalized receptor-dependent agonist functions (inhibit IL-1β induced calcium mobilization).Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du système nerveux central (SNC). Leur grande expression en filaments intermédiaires, la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), est une caractéristique permettant leur identification. Les astrocytes sont d'importants contributeurs aux événements biochimiques du SNC et jouent un rôle clé dans le processus de régulation des dommages et de la guérison du SNC. Sous des conditions d'inflammation chronique, tel la Sclérose en Plaques (SP), les astrocytes subissent des changements pathophysiologiques causant l'astrogliose (Liberto, Albrecht et al. 2004; Sidoryk-Wegrzynowicz, Wegrzynowicz et al. 2011). Ce mécanisme de cicatrisation est commun dans la SP et un nouvel agent thérapeutique, FTY720 (fingolimod, Gilenya™) démontre des effets protecteurs du SNC en prévenant l'évolution de l'astrogliose. (Choi, Gardell et al. 2011). FTY720 est un agent thérapeutique récemment approuvé pour traiter la SP. Il est administré oralement et a la capacité d'accéder au SNC. Une fois en place dans ce système, cet agent entre en contact direct avec le récepteur sphingosine-1-phosphate (S1PR) sur les astrocytes. Les réponses des astrocytes en réaction aux signaux générés par ce récepteur sont reliées à la pathologie de la SP. Cette thèse examine les signaux engendrés par FTY720 ainsi que ses fonctions sur les astrocytes humains primaires. Nous avons utilisé des astrocytes isolés à partir de SNC humains fœtaux pour examiner les réponses neuro-inflammatoires générées par l'administration quotidienne de FTY720. FTY720 agit initialement comme un agoniste en activant le récepteur S1P, mais il agit également comme un antagoniste en causant l'internalisation et la dégradation de ce récepteur. Nous avons examiné ces deux phénomènes de façon à savoir s'ils agissent en concert. Nous affirmons qu'un récepteur internalisé par FTY720 continue de générer des signaux pour une période de temps prolongée (heures). Une addition simple de FTY720 désensibilise l'astrocyte, pour une période de >24h, au signal de phosphorylation de ERK (pERK) qui est généré par le récepteur extracellulaire. Cette période réfractaire du signal de transduction de pERK fût maintenue dans les astrocytes traités quotidiennement avec FTY720, sinon le signal pERK reparaît 72 heures après le traitement initial. De plus, la désensibilisation du récepteur fût reliée à l'absence de réponse proliférative induite par le ligand naturel sphingosine-1-phosphate (S1P). Nous avons aussi démontré que le traitement quotidien des astrocytes avec FTY720 atténue la capacité de IL-1β à activer les voies moléculaires sensibles au calcium. Le traitement quotidien avec FTY720 n'inhibe pas les signaux de pERK lorsque les astrocytes sont stimulés à l'aide de sérum, ni la sécrétion de IL-6 ou de IP-10 lorsqu'ils sont stimulés avec IL-1β. Nos résultats suggèrent que l'exposition quotidienne à FTY720 agit comme un antagoniste aux stimuli extérieur (tel le ligand naturel S1P) ainsi qu'un agoniste lorsque le récepteur est internalisé (inhibe la mobilisation du calcium lorsqu'exposé à IL-1β)