Functional regulation of P2X receptor channels by phosphoinositides

Long after its initial discovery as part of DNA and as the main source of energy in the cell, the nucleotide adenosine-5'-triphosphate (ATP) is now rightfully considered as an important extracellular signalling molecule. It is now known that purinergic transmission plays significant physiological roles, notably in neuro- and gliotransmission, in the modulation of the innate and adaptive immune response, in smooth muscle constriction and in regulating blood clotting. It is also actively involved in the generation and maintenance of various pathological states, including chronic neuropathic and inflammatory pain.How purinergic signalling can be implicated in such a diverse array of mechanisms via only one signalling molecule comes from the variety of receptors that are activated by ATP. Two major types of ATP-sensitive receptors exist: the P2X ionotropic receptor channels and the metabotropic P2Y receptors. The P2X family of ATP-gated ion channels is composed of seven subunits that assemble as trimers to form receptors with various functional and pharmacological profiles. Like all ion channels, the activity of P2X receptor channels is tightly regulated by orthosteric and allosteric regulation mechanisms. This thesis provides evidence of a novel type of post-translational regulation mechanism where the levels of intracellular phosphoinositides (PIPn) modulate the channel activity of P2X receptors. The first article included in my thesis focuses on the P2X1 subtype, which is mainly involved in smooth muscle constriction in blood vessels and vas deferens, as well as in the control of platelet aggregation and blood clotting. We demonstrate that the activity of the P2X1 receptor channel is positively regulated by membrane PI(4,5)P2 (PIP2). Depleting the intracellular levels of PIP2 decreased the ATP-activated current carried through the P2X1 channel and had an inhibitory effect on ATP-mediated mesenteric artery constriction, a P2X1-dependent process. Direct binding between the P2X1 cytosolic tail and PIP2 is shown to be necessary for the full expression of P2X1 activity.The next article in this thesis describes the PIPn-dependent regulation of the P2X4 receptor channel, which is highly involved in the generation of neuropathic and inflammatory pain through its expression in spinal cord microglia. Results obtained show that complete P2X4 function is dependent on the levels of PIP2 and PI(3,4,5)P3 (PIP3). Both species of phospholipids potentiate the P2X4-mediated ionic current and calcium entry by directly binding to the C-terminal domain of P2X4 subunits. Activation of co-expressed microglial metabotropic receptors can trigger changes in PIP2 or PIP3 levels, which could affect the contribution of P2X4 in pain-inducing mechanisms.In the third report, we investigate the molecular characteristics of the interaction between membrane PIPn and the various P2X receptors that were shown to be directly modulated by the phospholipids. By analyzing the functional and PIPn-binding effects of various mutations performed on the C-terminal domain of the PIPn-sensitive P2X1, P2X4 and P2X7 subtypes as well as on the PIPn-insensitive P2X5 subtype, we identify the PIPn-binding regulatory motif of P2X receptors. The last article included in this thesis examines the dynamic changes in channel permeability brought by sustained activation of the microglial P2X4 receptor. We show that upon sustained ATP application, P2X4 channels form large conductance pores allowing the flux of large organic molecules. The large pore formation of co-expressed microglial P2X7 receptors has been extensively studied; we show here that P2X4-mediated permeation is mechanistically distinct and, in contrast with P2X7, does not induce membrane blebbing or cell death. Furthermore, we demonstrate that membrane PIPn potentiate the formation of this high-conductance P2X4 pore, suggesting that this property can be regulated by metabotropic changes in PIPn levels.Longtemps après la découverte de sa présence dans l'ADN et de son rôle en tant que principale source d'énergie chimique dans la cellule, le nucléotide adenosine-5'-triphosphate (ATP) est maintenant considéré comme une importante molécule de signalisation extracellulaire. La transmission purinergique est activement impliquée dans plusieurs processus physiologiques, notamment dans la neuro- et glio-transmission, la modulation de la réponse immunitaire innée et adaptative, la constriction vasculaire et la coagulation sanguine. Elle participe aussi à la génération et au maintien de divers états pathologiques, tels la douleur chronique neuropathique et inflammatoire.La signalisation purinergique est impliquée dans des processus aussi diversifiés par l'entremise d'une seule molécule de signalisation grâce à une grande variété de récepteurs activés par l'ATP. Les deux principaux types de récepteurs sensibles à l'ATP sont les récepteurs ionotropiques P2X et les récepteurs métabotropiques P2Y. La famille P2X de canaux ioniques activés par l'ATP est composée de sept sous-unités qui s'assemblent comme trimères pour former des récepteurs possédant divers profils fonctionnels et pharmacologiques. Comme tous les canaux ioniques, l'activité des P2X est étroitement régulée par des mécanismes de régulation orthostériques et allostériques. Cette thèse démontre l'existence d'un nouveau type de mécanisme de régulation post-traductionnel, où les niveaux de phosphoinositides (PIPn) intracellulaires modulent l'activité de canal ionique des récepteurs P2X.Le premier article porte sur le sous-type P2X1, qui contribue à la contraction des muscles lisses dans les vaisseaux sanguins et le canal déférent, ainsi qu'à l'agrégation plaquettaire. Nous démontrons que l'activité du récepteur canal P2X1 est positivement régulée par les PI(4,5)P2 (PIP2) membranaires. La déplétion des niveaux intracellulaires de PIP2 diminue l'amplitude du courant ionique induit par P2X1. Nous montrons que le couplage direct entre le domaine C-terminal cytosolique de P2X1 et PIP2 est nécéssaire pour l'expression complète de l'activité de P2X1.Le second article de cette thèse décrit la régulation PIPn-dépendante du récepteur canal P2X4, qui joue un rôle majeur dans la génération et le maintien de la douleur neuropathique et inflammatoire par son expression dans les microglies de la moelle épinière. Nous démontrons que le fonctionnement de P2X4 dépend des niveaux de PIP2 et de PI(3,4,5)P3 (PIP3). Les deux types de phospholipides potentialisent le courant ionique ainsi que l'entrée de calcium par le canal P2X4 en se liant directement au domaine C-terminal des sous-unités P2X4. Dans le troisième rapport, nous étudions les caractéristiques moléculaires de l'interaction entre les PIPn membranaires et les récepteurs P2X directement modulés par ces phospholipides. En analysant les effets fonctionnels de diverses mutations effectuées sur le domaine C-terminal des sous-types PIPn-dépendant P2X1, P2X4 et P2X7 et sur le sous-type PIPn-indépendant P2X5, nous identifions le motif nécessaire à la liaison P2X-PIPn et à la régulation fonctionnelle du canal par les PIPn.Le dernier article de cette thèse examine les changements dynamiques de la perméabilité du canal ionique apportés par une activation soutenue des récepteurs microgliaux P2X4. Nous montrons que, lors d'une application soutenue d'ATP, les canaux P2X4 forment des pores à haute conductance permettant le flux de molécules organiques à haut poids moléculaire. La formation de larges pores par les récepteurs P2X7 a été étudiée intensivement; nous démontrons ici que la perméation induite par P2X4 est mécanistiquement distincte et, à l'opposé de P2X7, ne mène à aucun réarrangement de la structure membranaire ni à la mort cellulaire. Les PIPn membranaires potentialisent la formation de ces pores à haute conductance par P2X4, suggérant que cette propriété peut être régulée par des changements intracellulaires des niveaux de PIPn