Generation of a mouse model to study the temporal relationship between BRAFV600E expression and PTEN silencing in melanoma development

Metastatic melanoma is a devastating and poorly understood disease that is extremely resistant to current approved therapeutic regimens. The earliest and most common observed genetic alteration encodes constitutively active BRAF-V600E (BRAFV600E) which promotes sustained activation of the BRAF-MEK-ERK MAP kinase signaling pathway. BRAFV600E is detected in 85% of human nevi and ~65% of metastatic melanomas. Progression from nevi to melanoma is thought to require the subsequent functional loss of at least one tumor suppressor gene, commonly PTEN. We have previously demonstrated that the concomitant activation of BRAFV600E and PTEN silencing led to the appearance of highly pigmented melanocytic skin lesions with histological features of melanoma. However, human tumors do not develop mutations simultaneously. Thus, to study melanoma progression in vivo, we will initiate BRAFV600E expression and PTEN silencing independently with Flp and Cre respectively. We have previously generated mice carrying a Flp-activated BRAFV600E allele (BRAFFA), which expresses normal BRAF prior to Flp-mediated recombination, at which point BRAFV600E is expressed. Similarly, we have a conditional PTEN allele that becomes inactivated upon Cre-mediated recombination.To separate BRAFV600E activation and PTEN silencing in vivo, I attempted to generate a transgenic mouse expressing inducible forms of Cre and Flp recombinases in a melanocyte-specific manner (pTyr:CreER and pTyr:FlpPR). The two constructs were co-integrated into the genome of C57BL/6 zygotes, generating five Tyr:FC founder strains. In vitro analysis of the constructs demonstrated melanocyte specificity and appropriate inducibility and specificity for recombination sequences. However, zero of five Tyr:FC strains demonstrated recombinase expression or function in vivo. The reason behind this lack of expression remains unknown but is most likely attributed to the co-injection technique, too few founder strains for analysis, or faults in the pTyr constructs.Le mélanome est une maladie dévastatrice et excessivement résistante aux thérapies actuelles sur laquelle nos connaissances sont très limitées. Un des événements génétiques initiateurs de la maladie, qui est également le plus fréquemment observé, est une mutation qui encode une forme constitutivement active de BRAF-V600E (BRAFV600E), ce qui mène à une activation soutenue de la voie MAP kinase BRAF-MEK-ERK. BRAFV600E est détecté dans 85% des naevus et environ 65% des mélanomes métastatiques. On considère que la perte d'au moins un gène suppresseur de tumeur, par exemple PTEN, est nécessaire pour la progression d'un naevus à un mélanome. Nous avons précédemment démontré que l'activation de BRAFV600E couplée avec une perte d'expression de PTEN menait à l'apparition de lésions mélanocytiques hautement pigmentées avec certaines caractéristiques histologiques du mélanome. Par contre, les tumeurs humaines ne subissent pas de telles mutations de façon simultanée. Ainsi, pour étudier la progression du mélanome in vivo, nous allons initier l'expression de BRAFV600E et l'ablation de l'expression de PTEN de façon indépendante avec les recombinases Flp et Cre respectivement. Nous avons précédemment généré une souris portant un allèle de BRAFV600E activé par Flp ("Flp-activated", BRAFFA) qui exprime une version normale de BRAF au préalable et BRAFV600E après la recombinaison par la Flp. Nous avons également un allèle de PTEN qui est inactivé suite à la recombinaison par la recombinase Cre. Pour séparer l'activation de BRAFV600E et l'ablation de PTEN in vivo¸ j'ai tenté de générer une souris transgénique exprimant des formes inductibles des recombinases Cre et Flp spécifique aux mélanocytes (pTyr:CreER et pTyr:FlpPR). Les deux constructions ont été co-intégrées dans le génome de zygotes C57BL/6, ce qui a généré cinq lignées fondatrices. L'analyse in vitro a démontré que l'expression des constructions était spécifique aux mélanocytes et que l'induction des recombinases ainsi que leur spécificité pour les sites de recombinaison étaient appropriées. Par contre, l'expression ou l'activité de l'une ou l'autre des recombinases n'a été détectée dans aucune des cinq lignées Tyr:FC. La cause derrière cette absence d'expression reste inconnue mais elle est probablement attribuable à la technique de co-injection, le nombre limité de lignées fondatrices ou des défauts dans les constructions pTyr