Structural analysis of the reaction cycle of aminoglycoside 6'- N-acetyltransferase type-li, an aminoglycoside- resistance factor

Antibiotic resistance is a serious concern in nosocomial bacterial infections. The extensive use of antibiotics has led to the emergence of multidrug-resistant bacteria such as Enterococci. Strains of E. faecium are frequently encountered that are resistant to a diverse range of antibiotics, including beta-lactams, glycopeptides, as well as aminoglycosides. The resistance profile of E. faecium to many aminoglycosides is attributed to an acetyltransferase. The enzyme, aminoglycoside 6'-N-acetyltransferase type-Ii (AAC(6')-Ii), uses acetyl coenzyme A (AcCoA) to modify all clinically relevant aminoglycosides that contain a 6'-amino sugar. Such modifications render aminoglycosides incapable of binding to the 30S bacterial ribosome, thereby preventing antibiotics from inducing protein mistranslation and thus abolishing their bactericidal properties.We aimed to explore different possibilities to restore aminoglycoside susceptibility by either protecting aminoglycosides from being modified by AAC(6')-Ii or inhibiting the enzyme so that it can no longer modify aminoglycosides. To this end, we pursued the structural description of the entire AAC(6')-Ii reaction cycle. AAC(6')-Ii employs an ordered sequential mechanism, where AcCoA binds prior to the substrate, and where the modified substrate leaves before coenzyme A (CoASH). Thus, the enzyme cycles through four distinct states: apo, AcCoA complex, ternary complex, and CoASH complex. Two out of the four states (AcCoA and CoASH complexed forms) had already been structurally characterized. In addition, diverse mutagenesis and kinetic studies have determined many aspects of the kinetic mechanism governing the enzyme. However, the most important states (apo and ternary state) remain uncharacterized and no conclusive AAC(6')-Ii reaction mechanism has been proposed.Here, we report structural studies for the two remaining states of AAC(6')-Ii. X-ray crystallographic studies of the apo and ternary complex permitted us to describe conformational changes between the different states, define the active site/binding pocket of the enzyme, and rationalize its broad substrate specificity. Complementary solution methods such as nuclear magnetic resonance (NMR), circular dichroism (CD) and small angle X-ray scattering (SAXS) allowed us to gain a better understanding of the dynamics of conformational changes between the apo and complexed states. Estimating quantitative binding energies between the enzyme and several aminoglycosides enabled us to postulate a complete reaction mechanism and extend this mechanism to other acetyltransferases. Ultimately, this detailed structural analysis of AAC(6')-Ii allows us to propose avenues to rejuvenate aminoglycoside therapy against multidrug-resistant pathogens such as E. faecium.La résistance aux antibiotiques est un grave problème pour les infections nosocomiales bactériennes. L'utilisation excessive d'antibiotiques a conduit à l'émergence de bactéries multirésistantes telles que Enterococci. Plusieurs souches d'E. faecium sont résistantes à un large éventail d'antibiotiques, dont les bêtalactamines, les glycopeptides et les aminoglycosides. Le profil de résistance d'E. faecium à plusieurs aminoglycosides est attribué en majeure partie à une acétyltransférase. Cette enzyme, aminoglycoside 6'-N-acétyltransférase de type-Ii AAC(6')-Ii, se sert de l'acétyl-coenzyme A (AcCoA) pour modifier, en position 6', tous les aminoglycosides utilisés en milieux hospitaliers. Ces modifications rendent les aminoglycosides incapables de se lier à la sous-unité 30S du ribosome bactérien, empêchant ainsi l'antibiotique de modifier la traduction des protéines et entraînant donc la suppression de ses propriétés bactéricides.Le but premier de cette étude était de déterminer par quels moyens il serait possible de redonner aux aminoglycosides leur sensibilité, soit en les protégeant d'une modification par AAC(6')-Ii ou en inhibant directement l'enzyme, de sorte qu'elle ne puisse plus modifier les aminoglycosides. À cette fin, nous avons commencé par décrire, à partir de la structure d'AAC(6')-Ii, le cycle des réactions de l'enzyme menant à l'inactivation des aminoglycosides. AAC(6')-Ii utilise un mécanisme séquentiel ordonné, où AcCoA se lie à l'enzyme avant le substrat et où le substrat modifié quitte le site actif avant la coenzyme A (CoASH). Ainsi, la réaction enzymatique se décrit en quatre états distincts: apo, complexe AcCoA, complexe ternaire et complexe CoASH. Deux de ces états (AcCoA et CoASH complexés) ont déjà été caractérisés structurellement. De plus, diverses mutagenéses et études cinétiques ont minutieusement déterminé de nombreux aspects des mécanismes cinétiques régissant l'enzyme. Toutefois, les états les plus importants (apo et ternaire) sont toujours indéterminés et aucun mécanisme concluant n'a été proposé pour l'activité d'AAC(6')-Ii.Nous présentons ici les deux états enzymatiques manquants d'AAC(6')-Ii. Les cristallographies par rayons X des complexes apo et ternaire nous ont permis de décrire les changements de conformation entre les différents états, de définir le site de liaison et le site actif de l'enzyme, et de rationaliser son large spectre de substrats. Grâce à des méthodes complémentaires telles que la résonance magnétique nucléaire (RMN), le dichroïsme circulaire (CD) et la diffusion de rayons X à petit angle (SAXS) nous avons pu mieux comprendre la dynamique qui guide les changements de conformation entre les états apo et complexés. Des estimations quantitatives des énergies de liaison entre l'enzyme et les aminoglycosides nous ont ainsi permis de proposer un mécanisme réactionnel complet pour AAC(6')-Ii et d'étendre ce mécanisme à d'autres membres de la famille des acétyltransférases. Pour conclure, ces études détaillées de la structure d'AAC(6')-Ii nous permettent de proposer des pistes vers l'élaboration de solutions pour surmonter la résistance aux aminoglycosides de pathogènes tels que E. faecium