Bioavailability and biodegradation of organic xenobiotic recalcitrant polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in different soil environments

Bacterial isolates from soils contaminated with a large range of organic pollutants were tested for their ability to metabolise selected recalcitrant PAHs as their sole energy and carbon source. Plating of soil microorganisms isolated from 12 petroleum-contaminated soils on solid medium, supplemented with the PAH phenanthrene as sole carbon source, yielded 228 phenanthrene-degrading bacterial strains, of which 60 were further characterized. Southern DNA-DNA hybridization identified 14 of the 60 colonies as potentially competent in naphthalene degradation (ndoB Positive). The 14 bacterial isolates were further screened for their capacity to mineralize six radiolabelled PAHs serving as their sole carbon and energy source. Under such conditions, bacterial isolate strain S65 cumulatively mineralized 61% of phenanthrene, 61% of pyrene, and 24% of fluoranthene over a 9-day period, but could not degrade naphthalene, anthracene or fluorene.Three different characterisation approaches were applied to isolate S65 (designated Mycobacterium sp. Strain S65 in Genbank): (i) micro/macro-morphological — phase-contrast microscopy showed S65 to be a Gram variable rod-coccus; S65 produced creamy yellow circular colonies that were catalase-positive, (ii) molecular — HPLC analysis of Strain S65's cell wall mycolic acids indicated it was a novel Mycobacterium, (iii) molecular — species confirmed by others' 16S rRNA gene sequence analysis. Strain S65's mineralization kinetics also showed it to be a new and unique PAH-degrading Mycobacterium.Strain S65's capability and capacity to mineralize 14C-labelled phenanthrene or pyrene, allowed to age in sterile farm soil microcosms for 0, 30, 180 or 360 days prior to inoculation with S65, was quantified on the basis of cumulative 14CO2 evolution 1, 3, 6, or 9 days after inoculation, and expressed as a percent of the initial PAH concentration. For each ageing period, a factorial combination of four soil types (Sandy-Loam, Sand, Clay, Clay-Loam), two levels of soil organic matter (high, low), and two concentrations of PAH substrate (phenanthrene, 250 or 500 mg L-1; pyrene, 500 or 1000 mg L-1), was replicated six times, with three replicates receiving 1.0 × 107 CFU of live S65 and 3 'negative' controls receiving heat-killed S65. Un-inoculated soil microcosm controls were implemented, as well as 'positive' controls in liquid growth medium. Results were analysed by ANOVA. Strain S65 required a 3-day lag to initiate the degradation of non-aged (day 0) phenanthrene, but proceeded immediately with pyrene. Cumulative mineralization of phenanthrene from day 3 to day 9 at either initial PAH concentration was greater in sandy-loam soil with low organic matter than in clay-loam soil with high organic matter (18.5-20.0% vs. 13.5-14.5% on day 0; 13.0-14.5% vs. 10.5-11.5% after 30 days' ageing). Cumulative mineralization of pyrene reached 18.5% and 19%, respectively (for initial concentrations of 500 or 1000 mg L-1) after 24 hours, close to the maximum reached at 9 days (no time lag occurred). After 9 days, for both initial concentration, pyrene mineralization was greater in sandy-loam soil with low organic matter than clay-loam soil with high organic matter (20.0-21.0% vs. 14.5-15.5% on day 0; 13.25-14.0% vs. 11.5-12.5% after 30 days' ageing). Overall mineralization declined as ageing progressed; in particular, for 180- and 360-day aged PAHs, cumulative mineralization dropped below 10%, well below rates for shorter ageing times. This suggests that as their ageing in the soil medium proceeds, phenanthrene and pyrene become less accessible to degradation.This multidisciplinary study highlights the fact that Mycobacterium sp. Strain S65 shows a great potential to be useful in biodegradation of high molecular weight PAHs., and strongly supports the general concept of Mycobacteria having a significant role in PAHs-biodegradation, bioremediation, and biodetoxification in contaminated environments.La capacité d'isolats bactériens, provenant de sols contaminés avec une grande variété de polluants organiques, à métaboliser une sélection de HAPs rémanents comme source unique d'énergie et de C, fut évaluée. La mise en culture de microbes du sol provenant de 12 sols contaminés par des substances pétrolières sur une gélose avec un ajout de phénanthrène, représentant l'unique source de C, identifia 228 souches bactériennes pouvant décomposer la phénanthrène. Les 14 colonies pouvant dégrader la naphthalène (ndoB+) furent triés selon leur capacité à minéraliser six HAPs. Sur 9 jours la minéralisation cumulative de phénanthrène ou de pyrène par l'isolat S65 fut de 61%, et 24% pour la fluoranthène. Cet organisme ne put minéraliser la naphthalène, l'anthracène ou la fluorène. L'isolat S65 (designé Mycobacterium sp. isolat S65 dans Genbank) fut caractérisé: (i) micro/macro-morphologique — la microscopie montra que S65 était un bâtonnet-coccus, gram-variable, aux colonies d'un jaune crémeux et catalase-positif, (ii) moléculaire — une analyse par CLHP des acides mycoliques de la paroi cellulaire de l'isolat S65 indiqua qu'il s'agissait d'une nouvelle espèce de Mycobacterium, (iii) moleculaire — le genre fut confirmé par d'autres par une analyse génétique. La cinétique de minéralisation des HAPs par l'isolat S65 confirma aussi qu'il représentait une espèce nouvelle et unique de Mycobacterium, compétente dans la dégradation des HAPs. La capacité de minéralisation de l'isolat S65 et le taux de minéralisation de pyrène et de phénanthrène radiomarqués ayant subi un vieillissement pour 0, 30, 180 ou 360 jours dans un microécosystème en sol agricole avant leur inoculation avec l'isolat S65, furent quantifiées par l'évolution cumulée de 14CO2, 1, 3, 6, or 9 jours après l'inoculation. Pour chaque vieillissement, une combinaison factorielle de quatre types de sol (loam sableux, sableux, argileux, loam argileux), deux niveaux de matière organique (MO) du sol (élevé, bas), et deux concentrations de substrat HAP (phénanthrène, 250 ou 500 mg L 1; pyrène, 500 ou 1000 mg L-1) furent évalués. Trois des six réplicats reçurent 1.0 × 107 CFU de S65 vivant et trois témoins 'negatifs' reçurent des cellules thermostérilisées. Des microécosystèmes n'ayant reçu aucune inoculation, ainsi que des témoins 'positifs' en culture liquide s'ajoutèrent à ceux-ci. Les données furent soumises a une ANOVA.L'isolat S65 nécessita 3 jours avant de commencer à dégrader la phénanthrène non-vieilli (jour 0), mais commença immédiatement avec le pyrène. La minéralisation du phénanthrène du jour 3 au jour 9, pour toutes concentrations de HAP, fut plus élevée pour le loam sableux avec peu de MO que pour le loam argileux avec beaucoup de MO (18.5-20.0% vs. 13.5-14.5% sans vieillissement, jour 0; 13.0-14.5% vs. 10.5-11.5% après 30 jours de vieillissement). La minéralisation cumulative de pyrène atteignit 18.5% et 19% (500 ou 1000 mg L-1, respectivement) après 24 hr, près du niveau maximum atteint à 96 hr (i.e., sans aucun délai). Pour quelque concentration de HAP que ce soit, la minéralisation cumulative de pyrène du jour 3 au jour 9 fut plus élevée pour le loam sableux avec peu de MO que pour le loam argileux avec beaucoup de MO (20.0-21.0% vs. 14.5-15.5% sans vieillissement, jour 0; et 13.25-14.0% vs. 11.5-12.5% après 30 jours de vieillissement). La minéralisation diminua avec la progression du vieillissement. Pour les HAP vieillis 180 ou 360 jours, la minéralisation cumulé diminua en deçà de 10%, soit plus bas que pour les vieillissements plus courts. Donc, lorsque que leur vieillissement dans le sol avance, la phénanthrène et le pyrène deviennent moins accessibles à la dégradation. L'isolat S65 du genre Mycobacterium sp. démontre un potentiel utilitaire vis à vis la biodégradation de HAPs de poids moléculaire élevé, et soutient l'idée que les Mycobacteries ont un rôle dans la biodégradation, biorestauration et biodétoxication des HAPs dans les environnements contaminés