The study of allostery in aminoglycoside N-6'- acetyltransferase through the use of calorimetry and spectroscopy

Allostery is the change in structure, dynamics and/or function in biological macromolecules upon binding to a target molecule. Since its initial proposal, allostery has been shown to be essential to cellular function. One result of allostery is the cooperative binding of identical ligands to the same macromolecule. One enzyme which has shown interesting kinetic behaviour is Aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-Ii (AAC(6')-Ii), an antibiotic resistance causing enzyme chromosomally encoded in Enterococcus faecium. This enzyme is responsible for the low level resistance to aminoglycosides found in these bacteria. AAC(6')-Ii belongs to the GCN5-related N-acetyltransferase (GNAT) super family, and its known function is to acetylate most known aminoglycosides at the 6' position. It is constitutively active as a homo dimer and has previously shown cooperative behaviour between the subunits. A technique utilized in the studying of the cooperative binding observed with AAC(6')-Ii is isothermal titration calorimetry. However, studying allosteric cooperativity can be quite challenging due to the difficulty in identifying the correct binding model. Chapter 2 of this thesis describes a protocol to address this problem through performing multiple ITC experiments at different concentrations and globally fitting the dataset to a single set of binding parameters. This technique has been labelled Variable-c ITC. Many allosteric interactions occur through the change of structure. Chapter 3 describes an approach which combines ITC with circular dichroism spectroscopy to identify a linked folding event. In addition, we developed a novel fitting approach for a multiple temperature ITC dataset by introducing the van 't Hoff isochore as a restriction. The protocol developed in Chapter 3 was then used in Chapter 4 and 5 to identify allosteric events in the binding of Acetyl coenzyme A (AcCoA) and aminoglycosides to AAC(6')-Ii, respectively. Nuclear magnetic spectroscopy (NMR) was combined with the thermodynamic data to develop a model to explain the observed cooperativity. When AAC(6')-Ii binds AcCoA one subunit folds into a bound conformation which is reminiscent to a KNF folding model. This destabilizes the interactions between the two subunits and reduces the unbound subunits stability, causing it to unfold at lower temperatures. This produces to separate opposing cooperative events which causes AcCoA to bind with positive cooperativity at lower temperatures and negative cooperativity at higher temperatures. Intriguingly, when AAC(6')-Ii binds aminoglycosides it appear that both subunits undergo a conformational change with the first binding event. This likely stabilizes the unbound subunit, causing to unfold at a higher temperature. This behaviour suggests that AAC(6')-Ii has ligand dependent allosteric processes and behaves quite differently depending on which ligand it binds.L'allostérie est définie par le changement de la structure, de la dynamique et/ou de la fonction des macromolécules biologiques lors de la liaison à une molécule cible. Depuis sa proposition initiale, l'allostérie a été démontré d'être une contribution essentielle pour le fonctionnement cellulaire. Un des résultats de l'allostérie est la liaison coopérative de ligands identique à la même macromolécule. Une enzyme qui a demontré des comportements cinétiques intéressants est aminoglycoside N-6'-acétyltransférase-Ii (AAC(6 ')-Ii), une enzyme qui provoque une résistance aux antibiotiques et encodé dans les chromosomes de Enterococcus faecium. Cette enzyme est responsable de la résistance de bas niveau aux aminoglycosides trouvés dans ces bactéries. AAC (6 ')-Ii appartient à la super-famille des GCN5 N-acétyltransférase (GNAT), et sa fonction connu est d'acétyler les aminoglycosides les mieux décrits à la position 6 '. Il est constitutivement actif sous forme d'homodimère et a déjà montré un comportement de coopération entre les sous-unités.Une technique utilisée dans l'étude de la liaison coopérative observée par AAC(6')-Ii est la calorimétrie de titration isothermique (ITC). Cependant, l'étude de la coopérativité allostérique peut être assez difficile en raison de la difficulté d'identifier le modèle de liaison approprié. Le chapitre 2 de cette thèse décrit un protocole pour traiter ce problème par l'exécution de multiples expériences ITC à différentes concentrations et par l'ajustement global de l'ensemble de données à un ensemble unique de paramètres de liaison. Cette technique a été nommé Variable-c ITC. Plusieurs interactions allostériques se produisent par le changement de structure. Le chapitre 3 décrit une approche qui combine la ITC avec la spectroscopie de dichroïsme circulaire pour identifier un événement de pliage lié. De plus, nous avons développé une nouvelle approche d'ajustement pour un ensemble de données de ITC à multiples températures en introduisant le isochore de van't Hoff en tant que restriction. Le protocole présenté dans le chapitre 3 a ensuite été utilisé dans les chapitres 4 et 5 pour identifier les événements allostériques de la liaison de la coenzyme Acetyl A (AcCoA) et des aminoglycosides à AAC (6 ')-II, respectivement. La spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) a été combinée avec les données thermodynamiques pour développer un modèle pour expliquer la coopérativité qui est observée. Lorsque AAC (6 ')-Ii se lie à AcCoA, une sous-unité se replie dans une conformation liée qui est semblable au modèle de pliage KNF. Ceci déstabilise les interactions entre les deux sous-unités et réduit la stabilité des sous-unités non liées, les amenant à se déplier à des températures plus basses. Ceci produit la séparation d'événements coopératifs opposants qui provoque AcCoA à se lier avec une coopérativité positive à des températures plus basses et une coopérativité négative à hautes températures. Curieusement, lorsque AAC (6 ')-Ii lie les aminoglycosides, il semblerait que les deux sous-unités subissent un changement de conformation avec le premier événement de liaison. C'est probablement ce qui stabilise la sous-unité non liée, l'amenant à se déplier à une température plus élevée. Ce comportement suggère que AAC (6 ')-Ii est allostériquement dépendant au ligand et se comporte très différemment selon le ligand auquel il se lie