Development of molecular markers for bruchid and mungbean yellow mosaic virus resistance in mungbean

中文摘要 豆象(Callosobruchus chinensis)是許多豆類及禾穀類種子儲藏期間之重要害蟲。綠豆主要栽培地區在南亞，栽培上主要限制因子之一是黃化嵌紋毒素病（mungbean yellow mosaic virus，MYMV）。重組自交系之基因型穩定，是構築遺傳圖譜之理想材料。因此本論文採用抗豆象野生種綠豆TC1966與抗黃化嵌紋病毒栽培種綠豆NM92雜交所衍生之200個F12重組自交系，進行抗豆象基因與抗黃化嵌紋病毒基因分子標誌之搜尋，並進行綠豆分子標誌圖譜之構築。 經豆象抗性評估，200個自交系有約111個完全不抗蟲，49個為百分之百抗蟲，其餘介於極抗與極感之間，顯示抗蟲表現除主要基因外，受到其他遺傳因子之修飾。藉由分離群体分组分析法（bulked segregant analysis，BSA），找到了四個與抗豆象基因連鎖之RAPD（random amplified polymorphic DNA）標誌，並轉換成再現性更理想之特定序列區域增殖片段（sequence characterized amplified region，SCAR）及切割擴增多型性標誌(cleaved amplified polymorphism，CAP)。所找到連鎖最緊密的標誌為由RAPD片段所衍生之共顯性CAP標誌opw02s2、opw02s3及opw02s4。從TC1966所選殖到opw02a4之SCAR片段顯示，所使用之引子可同時擴增兩個片段（1.5kb及1.6 kb），其序列經blastx比對顯示1.6 kb片段與NADH dehydrogenase 有高相關，1.5kb片段與Ty3-gypsy反轉位基因有高相關。此二基因表現是否影響到綠豆抗蟲能力之表現，有待進一步研究。 重組自交系在印度進行黃化嵌紋病害評估之資料顯示， 200個自交系中有63個比抗病親本抗病，有67個比感病親本感病，顯示兩親本均帶有提升抗病性因子。應用AFLP （amplified fragment length polymorphism）技術提高自交系間之多型性，尋求抗病相關標誌。將所有分子標誌（RAPD、CAP、AFLP）以MapMaker軟體進行圖譜構築，共定位254個分子標誌，分屬11個連鎖群，總共涵蓋約1514 cM之綠豆基因組。在NM92所找到抗病分子標誌，包括六個AFLP標誌及四個CAPs，均定位在第五連鎖群。其中CAP標誌在TC1966爲抗蟲，在NM92爲抗病，顯示抗病基因與感蟲基因為緊密連鎖；在TC1966找到的抗病因子初步定位在第六連鎖群。 由於200個自交系中有兩個同時抗病且抗蟲，因此未來可藉由這些材料進行兼具抗病與抗蟲品系之選育或抗蟲、抗病基因之選殖。Summary Aduki bean weevil (Callosobruchus chinensis) is a serious storage pest for seeds of many legumes and cereals. Mungbean yellow mosaic virus (MYMV) is one of the major constraints for mungbean production in south Asia, the major mungbean production region in the world. Recombinant inbred lines (RILs) have been one of the ideal populations for genetic mapping due to their high degree of genetic homogeneity and easy maintenance. Therefore, two hundred RILs were generated by cross of bruchid resistant wild species TC1966 [Vigna radiata var. sublobata (Roxb.) Verdc.] and MYMV resistant cultivar NM92 [Vigna radiata (L.) Wilczek]. The objectives of this dissertation were to develop molecular markers for bruchid and MYMV resistance genes and to construct genomic map for mungbean with these 200 RILs. Results of three bruchid bioassays indicated 111 RILs were completely damaged by bruchid, about 49 RILs showed complete resistantce, while others expressed intermediate phenotypes. These results suggested that the expression of bruchid resistance might be controlled by more than one major gene. Through bulked segregant analysis (BSA), we identified four RAPD (random amplified polymorphic DNA) markers for bruchid resistance. These RAPDs were converted into SCARs (sequence characterized amplified regions) and CAPs (cleaved amplified polymorphism). The best markers were co-dominant CAPs (opws2, opws3 and opws4) derived from RAPD fragment opw02a4. SCAR analysis of TC1966 with opw02a4 primers indicated amplification of two bands, i.e., 1.6 and 1.5 kb, respectively. BLASTX analysis indicated high sequence homology of the 1.6 kb band with NADH dehydrogenase gene and 1.5 kb band with RNA-directed DNA polymerase and Ty3-gypsy retroelement. The impacts of these genes on bruchid resistance deserved further study. MYMV evaluation of 200 RILs in India suggested that NM92 was merely tolerant to MYMV races in India. One third of the 200 RILs showed higher resistance than NM92, another one third were more susceptible than TC1966. The results implied resistant factors might be from both parents. AFLP (amplified fragment length polymorphism) technique was employed to explore markers for MYMV resistance gene. Linkage of all types of marker was analyzed by MapMaker 3.0 program. Six AFLPs and four CAPs, related with MYMV resistance of NM92 , were mapped in LG5 (linkage group No.5). These four CAPs in TC1966 pattern were bruchid resistant markers, while in NM92 pattern were MYMV tolerant markers. Linkage of bruchid resistance gene with MYMV susceptible gene in LG5 is significant. Two RILs showed high resistance to both bruchid and MYMV. These lines could be used in the future to breed elite mungbean varieties and clone genes related to resistance to bruchid and MYMV. The MYMV tolerant factor contributed by TC1966 was mapped in LG6. At present, a total of 254 markers were mapped successfully into 11 linkage groups, which account for about 1514 cM of mungbean genome.目錄 章節 頁次 中文摘要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .i 英文摘要. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . .ii 目錄. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .iv 表目錄. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .v 圖目錄. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .vi 第一章 緒言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 第二章 前人研究. . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . 4 ㄧ、 綠豆倉儲蟲害－豆象. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 二、 影響豆類作物抗蟲因子. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 三、 黃化嵌紋病毒. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 四、 分子標誌與圖譜構築. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 第三章 BSA策略與RAPD技術在抗豆象分子標誌上之應用. . . . . . . 20 一、 前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 二、 材料與方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21 三、 結果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23 四、 討論. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 第四章 抗豆象切割增殖多型性分子標誌之建立與相關序列之分析. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . 32 一、 前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32 二、 材料與方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33 三、 結果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34 四、 討論. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43 第五章 黃化嵌紋毒素病抗性基因之遺傳定位與綠豆分子標誌圖譜之構築. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 一、 前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46 二、 材料與方法. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47 三、 結果. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50 四、 討論. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 第六章 綜合討論. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65 參考文獻. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69 附錄1、選殖之RAPD序列. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8