Identification and characterization of genes in regulating differentiation of inflorescence from Arabidopsis thaliana

植物利用轉錄因子來因應環境的變化。MYB family 是阿拉伯芥中最大的一群轉錄因子(transcription factor)。本研究選殖並分析阿拉伯芥中的四個R2R3-type MYB基因，分別是AtMYB-like 1-4 四個基因。這四個基因具有相似的胺基酸序列，特別是在MYB domain 胺基酸序列的相似度最高。這四個基因mRNA表現情形相似，而且整個發育時期都有表現。在開花之後，其mRNA在花、花序莖、葉片及根都有表現。大量表現的AtMYBL1會改變花序的形成，有趣的是35S::AtMYBL2 也改變腋生花序的形成，並且喪失了花序莖的頂芽優勢。35S::AtMYB4也有類似於35S::AtMYBL2的特徵。這些結果指出AtMYBL1 、 AtMYBL2與AtMYB4調節了腋生分生組織的分化和花序的形成。在At1g13930 轉殖反股基因植物實驗中發現一個擁有獨特性狀，且在遺傳分析結果可能是單一T-DNA插入造成之隱性突變株，名為asr突變。這個asr突變株植株矮化，帶有捲曲狀異常花序莖以及發育短而分枝少的根部。經由IPCR鑑定發現這個T-DNA的插入位置是在At1g55265基因啟動子(promoter)及At1g55270基因3’ UTR處。這樣的結果指出At1g55265或是At1g55270這兩個基因可能參與調控花序和根部的發育。進一步分析這兩個基因的表現，發覺At1g55265可能是ASR基因。未來將以互補試驗，期望能夠更了解ASR基因在植物中花序形成與調節根部發育的作用機制。Transcription factors are important in regulating plant responses to environmental stress. In Arabidopsis the MYB family genes is one of the largest transcription factor gene families. We reported here the cloning and characterization of four R2R3-MYB genes, AtMYB-like 1-4 (AtMYBL1-4), from Arabidopsis. These four genes showed high sequence homology especially in the R2R3 domain. They also showed similar expression pattern and their mRNA was expressed throughout the development. After flowering, their mRNA was detected in flowers, inflorescence shoot, leaves, and root. Ectopic expression of AtMYBL1 in Arabidopsis altered inflorescence shoot formation. Interestingly, 35S::AtMYBL2 and AtMYBL4 also altered the formation of lateral inflorescence and lost apical dominance in transgenic plants. The result indicated that AtMYBL1, AtMYBL2,and AtMYBL4 are likely involved in the regulation of differentiation in shoot apical meristem and formation of inflorescence. A recessive mutation, asr, affecting inflorescence and root development was isolate from 35S::At1g13930 antisense transformant of Arabidopsis. The mutation show dwarf phenotype with winding inflorescence and short root. IPCR approach was applied to isolate the sequence flanking the left border of the T-DNA. The result indicated that the T-DNA was inserted at the promoter of At1g55265 and 3'UTR of At1g55270. The analysis of these two genes indiected that Atig55265 may encode the ASR gene. Further, characterized in this study should lead a deeper understanding of the mechanisms regulating differentiation during various developmental processes in plants.中文摘要………………………………………………………………………………1 英文摘要………………………………………………………………………………2 第一章、分析阿拉伯芥中四個R2R3-type MYBL genes 摘要……………………………………………………………………………………4 前言……………………………………………………………………………………5 材料與方法……………………………………………………………………………9 結果 一、AtMYBL1、AtMYBL2、AtMYBL3與AtMYBL4預測的基因資訊………………15 二、AtMYBL1、AtMYBL2、AtMYBL3與AtMYBL4在野生型阿拉伯芥中的表現情形………………………………………………………….…..…...…………………15 三、AtMYBL1、AtMYBL2、AtMYBL3與AtMYBL4的基因選殖…….….….…………16 四、野生型阿拉伯芥轉殖AtMYBL1、AtMYBL2、AtMYBL3與AtMYBL4基因之性狀與功能分析………………………………………………………..………………16 五、構築AtMYBL2 RNAi construct……………………….…………………………18 討論………………………………………………………………..…………………20 參考文獻……………………………………………………………………..………22 第二章、阿拉伯芥中asr突變株之定性分析 摘要………………………………………………………………………………..…58 前言…………………………………………………..………………………………59 材料與方法…………………………………………………………………..………60 結果 一、asr性狀分析……………………………………………………………..………63 二、IPCR分析結果………………………………………..…………………………63 三、asr突變株與野生型阿拉伯芥中，At1g55265基因與At1g55270基因表現量比較……………………………..………………………………………………………63 四、互補性試驗的進行…………………………...…………………………………64 討論………………………………………………………………………..…………67 參考文獻……………………………………..………………………………………68 第一章 圖表 表1-1、PCR反應中所使用的引子序列..………………………………..……..……28 圖1-1、 演化樹分析 100多個 R2R3-type MYB genes 以及四個 MYB-Like gene..…………………………………………….…………………...…..…….…….29 圖1-2、利用Bioedit 程式中BLAST功能，進行AtMYBL1、AtMYBL2、AtMYBL3與 AtMYBL4的胺基酸比對..…………………………………………...……….…30 圖1-3、AtMYBL1、AtMYBL2、AtMYBL3與AtMYBL4基因在野生型阿拉伯芥中的transcript表現量情形..……………………………………………….…..…..………31 圖1-4、AtMYBL2基因cDNA片段之分子選殖..…………………………….………32 圖1-5、AtMYBL3基因cDNA片段之分子選殖..………………………………….…33 圖1-6、AtMYBL4基因cDNA片段之分子選殖..………………………………….…34 圖1-7、利用PCR的方法確定AtMYBL2基因在pBI121載體中的方向性..…………35 圖1-8、利用PCR的方法確定AtMYBL3基因在pBI121載體中的方向性..…………36 圖1-9、利用PCR的方法確定AtMYBL4基因在pmGFP載體中的方向性..…………37 圖1-10、AtMYBL1、AtMYBL2、AtMYBL3與AtMYBL4轉殖實驗進度表……...38 圖1-11、 35S::AtMYBL2 轉殖株的異常性狀..…………………………..…………39 圖1-12、 35S::AtMYBL4 轉殖株的異常性狀..…………………………..…………40 圖1-13、AtMYBL2基因RNAi用之sense與antisense片段之分子選殖..……..……41 圖1-14 、利用colony PCR的方法確定AtMYBL2基因RNAi antisense片段接進pBlueACTi載體………………………………………………………...……………42 圖1-15 、利用colony PCR的方法確定RNAi sense片段接進pBlueACTi載體…....43 圖1-16 、利用colony PCR的方法確定來自pBlueACTi的RNAi 組合片段有送進pBI-mGFP1中..………….……………………………………..………..…...………44 圖1-17、構築AtMYBL2 RNAi 策略載體之轉殖實驗進度表……………...………45 附錄 附圖1-1、阿拉伯芥中保守的R2R3-type MYB domains的相似層次和一致的序列..…………………..….…………..……………………………………….……..…46 附圖1-2、blind對於蕃茄腋芽形成的影響..……………………………….….….…47 附圖1-3、 一T-DNA insertion造成的rax1突變株表現型…….……………………48 附圖1-4、35S::RAX2轉殖株的表現型…………………….……………………...…49 附圖1-5、rax1、rax2與rax3的單一與多重突變對於阿拉伯芥的腋生莖與腋生花序的影響……………………………………………………………………......………50 附圖1-6、以分子層次來引導側莖發育的模式..……………….………..……….…51 附圖1-7、pGEM®-T Easy vector之載體圖譜..……………..………………………55 附圖1-8、pB121之載體圖譜..……………………………………………..…………53 附圖1-9、pBI-mGFP1之載體圖譜..………………………………………….………54 附圖1-10、35S::AtMYBL1 sense轉殖植株之異常性狀……………………...………55 附圖1-11、pBlueACTi之載體圖譜..………………………………..……..…………56 第二章 圖表 表2-1、PCR反應中所使用的引子序列…………….……………………..…………69 圖2-1、野生型阿拉伯芥與asr homozygous line..……………………………………70 圖2-2、AtMYBL1、AtYipL1及 AtPTPL1基因的transcript表現情形..…………...…71 圖2-3、At1g55265基因cDNA片段之分子選殖..……………………..…..……….…72 圖2-4、At1g55270基因cDNA片段之分子選殖..………………………..……..……73 圖2-5、利用PCR的方法確定At1g55265基因或At1g55270基因在pCAMBIA1302載體中的方向性..………………………………………………….………..…….……74圖2-6、At1g55265基因與其上游promoter genomic DNA片段之分子選殖..………75圖2-7、利用PCR的方法確定At1g55265基因與其上游promoter genomic DNA片段在pEpyon-01H載體中的方向性..………….……………………………..…………76圖2-8、構築35S::At1g55265、35S::At1g55270與 At1g55265 promoter::At1g55265之轉殖實驗進度表………………………………………………………….………77 附圖 附圖2-1、野生型阿拉伯芥與asr 同質體突變株系....…………………..…………78 附圖2-2、IPCR分析結果.…………………………….……….…………..…………79 附圖2-3、pCAMBIA1302之載體圖譜………………………………….....…………80 附圖2-4、 pEpyon-01H之載體圖譜...………….……………………………………8