The amino acid residues affecting the thermostability of phosphoglucose isomerase from Bacillus subtilis

6-磷酸葡萄糖異構酵素（phosphoglucose isomerase，EC 5.3.1.9；簡稱PGI）是一個普遍存在一般生物體內的酵素，其功能在催化六磷酸葡萄糖與六磷酸果糖之間的轉換。此酵素的基因已經從許多不同的有機體中被選殖出來。分離自嗜中溫性Bacillus subtilis的6-磷酸葡萄糖異構酵素(PgiBS)在胺基酸序列上與分離自嗜熱性Bacillus stearothermophilus的6-磷酸葡萄糖異構酵素-A(PgiA)有81﹪的相同性及91﹪的相似性。酵素PgiA在62℃時的活性半衰期約為86.8小時，然而酵素PgiBS在相同溫度下卻極不穩定，其活性半衰期為0.52分鐘。為了找出造成PgiBS熱不穩定之結構上的決定因素，我們試著利用定點突變的方法置換PgiBS蛋白質序列上與PgiA不同的胺基酸，並分析突變後對蛋白質熱穩定性的影響。我們針對PgiBS上數個胺基酸做突變，並送入大腸桿菌(E. coli.)中大量表現。其中有兩個突變蛋白質，I117V與M371L，相較於野生株蛋白質，在活性半衰期上分別有3.8及3.5倍的增加；然而，Y307F突變蛋白的活性半衰期卻降低了3.2倍。結合I117V與M371L，我們得到一個雙重突變蛋白，其活性半衰期提高了5.6倍。未來，我們期望得到一個包含最少胺基酸取代的突變蛋白，擁有與PgiA相當的耐熱性。這樣的突變蛋白能幫助我們找出影響PgiBS熱穩定的主要胺基酸。The gene of phosphoglucose isomerase (PGI , EC 5.3.1.9), a ubiquitous house keeping enzyme catalyzing the inter-conversion between D-glucopyranose 6-phosphate and D-fructofuranose 6-phosphate, has been isolated from a variety of organisms. The enzyme isolated from mesophilic Bacillus subtilis (PgiBS) shares 81﹪identity and 91﹪similarity in amino acid sequence with that from thermophilic Bacillus stearothermophilus (PgiA). The half-life (t1/2) of PgiA is about 86.8 hours at 62℃; whereas, PgiBS is unstable at the same temperature with a t1/2 of 0.52 minutes. In order to find out the structural determinants resulting in the thermounstability of PgiBS, we attempted to replace each of the nonconsensus amino acids of PgiBS by site-directed mutagenesis, and analyze the mutational effects on protein thermostability. Several mutated proteins have been generated and expressed in E. coli. Two of them, I117V and M371L, have gained tolerance against thermoinactivation with a 3.8-fold and 3.5-fold increase in t1/2, respectively; whereas the mutant protein, Y307F, has become more vulnerable to heat with a decreasing t1/2 of 3.2-fold. Combining the two mutantions, I117->V and M371->L, the double mutant protein has an increasing t1/2 of 5.6-fold. In the future, we will continue to analyze the effects of other nonconsensus amino acids, and try to generate a mutated protein as stable as PgiA with fewest substitutions. This will help us to find out the key residues responsible for the thermostabilizing of PgiBS.目錄 頁 中文摘要 I 英文摘要 Ⅱ 目錄 Ⅲ 圖目錄 Ⅴ 表目錄 Ⅶ 壹、前言 1 6-磷酸葡萄糖異構酵素之功能 1 6-磷酸葡萄糖異構酵素之X光結晶學研究 2 枯草桿菌B. stearothermophilus之6-磷酸葡萄糖異構酵素 3 目前對蛋白質熱穩定性的研究 4 研究動機與目的 6 貳、材料與方法 8 菌株、質體與蛋白來源 8 枯草桿菌B. subtilis 6-磷酸葡萄糖異構酵素基因的選殖 8 蛋白質之表達與純化 10 聚合酶鏈鎖反應定點突變法 12 核苷酸定序法鑑定突變株 13 蛋白質定量 14 酵素動力學分析 14 參、結果 19 B.subtilis中6-磷酸葡萄糖異構酵素基因的蛋白質表現 與純化 19 突變點的選擇 19 6-磷酸葡萄糖異構酵素的熱穩定分析 21 肆、討論 23 伍、未來展望 27 陸、圖和表 28 柒、參考文獻 55 圖次 圖一、磷酸葡萄糖異構酵素所催化之異構反應 28 圖二、磷酸葡萄糖異構酵素參與醣類代謝途徑 29 圖三、B. stearothermophilus中6-磷酸葡萄糖異構酵素-B 的X光結晶結構圖 30 圖四、6-磷酸葡萄糖異構酵素-A及6-磷酸葡萄糖異構酵素-B 之胺基酸序列經DNAstar軟體比對結果 31 圖五、利用Swiss-Pdbviewer模擬之B. stearothermophilus中 6-磷酸葡萄糖異構酵素-A的立體結構圖 32 圖六、6-磷酸葡萄糖異構酵素-A及6-磷酸葡萄糖異構酵素-BS 之胺基酸序列經DNAstar軟體比對結果 33 圖七、質體pgiBS的構築 34 圖八、合併酵素分析法進行酵素活性分析圖 35 圖九、酵素之半衰期（half-life） 36 圖十、6-磷酸葡萄糖異構酵素-BS野生株純化步驟的 蛋白質電泳分析圖 37 圖十一、6-磷酸葡萄糖異構酵素-BS之結晶與X光繞射圖 38 圖十二、6-磷酸葡萄糖異構酵素-BS及6-磷酸葡萄糖異構酵素-B 之胺基酸序列經DNAstar軟體比對結果 39 圖十三、6-磷酸葡萄糖異構酵素-BS各突變株的蛋白質 電泳分析圖 40 圖十四、6-磷酸葡萄糖異構酵素-BS在不同加熱溫度下 的熱失活反應 41 圖十五、6-磷酸葡萄糖異構酵素-A在不同加熱溫度下 的熱失活反應 42 圖十六、酵素PgiBS與PgiA的熱失活反應活化能 43 圖十七、利用Swiss-Pdbviewer模擬PgiBS中I117的 3-D立體結構圖 44 圖十八、利用Swiss-Pdbviewer模擬PgiBS中I117及V117 的3-D立體結構圖 45 圖十九、利用Swiss-Pdbviewer模擬PgiBS中Y307的 3-D立體結構圖 46 圖二十、利用Swiss-Pdbviewer模擬PgiBS中Y307及F307 的3-D立體結構圖 47 圖二十一、利用Swiss-Pdbviewer模擬PgiBS中M371的 3-D立體結構圖 48 圖二十二、利用Swiss-Pdbviewer模擬PgiBS中M371及L371 的3-D立體結構圖 49 表次 表一、本實驗所使用之菌株 50 表二、定點突變所使用之引子 51 表三、B. subtilis 6-磷酸葡萄糖異構酵素野生株與突變株 的熱穩定性（活性半衰期）比較 53 表四、6-磷酸葡萄糖異構酵素PgiA與PgiBS在不同溫度下 的活性半衰期及熱失活反應活化能 5