Genetic engineering of a minimal oleosin for stabilizing artificial oil bodies

油體為植物種子內特有胞器，主要功能為儲存三酸甘油酯以提供種子發芽後生長所需的能量來源。油體的結構組成是由油體膜蛋白(Oleosin)和微量蛋白質及單層的磷酯質將三酸甘油酯包覆起來。油體膜蛋白主要由三個區域所組成：N端區域、中央疏水性區域、C端螺旋結構區。以目前研究結果得知，油體膜蛋白中央疏水區域在各物種中為一高度保留區，此疏水區域嵌入油體基質中的油脂，其兩端區域則裸露在油體表面，進而形成負電斥力以及空間結構上的立體屏障，得以讓油體穩定的保持一球狀結構。已有實驗證實，將油脂、磷脂質和油體膜蛋白三種物質混合，經超音波震盪後便能形成一穩定人造油體。利用人造油體技術已發展一純化系統，將目標蛋白構築在油體膜蛋白之後利用微生物系統表達，再利用人造油體的重組技術讓目標蛋白隨著油體膜蛋白跟隨到油體表面來，如此一來可以簡易的純化出目標蛋白質。此外，此系統的最大優點，是可以解決由微生物系統表現後蛋白質會失活的問題，在人造油體的重組過程中，目標蛋白會自身重組而恢復原有的活性。本研究利用基因工程將芝麻15kDa油體膜蛋白中央疏水區域six-stranded β-barrel漸進式剔除，探討此疏水區的長短是否影響油體的穩定性，以期找到中央疏水區域最小又能穩定人造油體的油體膜蛋白。根據實驗結果的觀察，中央疏水區域的結構漸進剔除後，各組修飾後油體膜蛋白仍可以成功的形成人造油體，而在此次的實驗結果中，比較穩定的油體是油體膜蛋白中央疏水區域結構剔除掉barrel 1以及barrel 1&6這兩組。Oleosins are structural proteins sheltering the oil bodies of plant seeds. The stability of oil body is a consequence of the steric hindrance and electronegative repulsion provided by oleosin. An oleosin molecule is proposed to comprise three distinct structural domains: an N-terminal amphipathic domain, a central hydrophobic antiparallel β-strand domain, and a C-terminal amphipathic α-helical domain. The possible structural function of the central hydrophobic domain is to anchor oleosins to the surface of oil bodies by penetrating the surface phospholipid (PL) layer and residing in the hydrophobic triacylglycerol (TAG) matrix. On the basis of the distinguishing characteristic, artificial oil bodies can be reconstituted with the three essential constituents, TAG, PL, and oleosin. In a previous study, a purification system via artificial oil bodies was set up to get the oleosin-fused polypeptides in Escherichia coli. In this study, I intend to shorten step by step the six-strand β-barrel in the central domain of sesame 15kDa oleosin. The goal of this study is to obtain a minimal central domain of oleosin that is capable of stabilizing artificial oil bodies.目錄 ………………………………………………………………………………… 1 圖目錄 ……………………………………………………………………………… 3 附圖目錄 …………………………………………………………………………… 4 中文摘要 …………………………………………………………………………… 5 英文摘要 …………………………………………………………………………… 6 第一章 前言………………………………………………………………………… 7 （一）、油體結構和組成………………………………………………………….. 7 （二）、芝麻油體膜蛋白的介紹………………………………………………….. 7 （三）、油體膜蛋白結構的特異性……………………………………………….. 8 （四）、油體膜蛋白的功能……………………………………………………….. 9 （五）、人造油體重組技術的發展和應用……………………………………….. 9 （六）、實驗目的和設計…………………………………………………………. 11 （七）、實驗架構…………………………………………………………………. 12 第二章 材料與方法……………………………………………………………….. 13 （一）、引子的設計………………………………………………………………. 13 （二）、聚合酵素連鎖反應………………………………………………………. 13 （三）、接合作用…………………………………………………………………. 13 目錄 （四）、重組質體之轉型作用…………………………………………………......14 （五）、質體的製備與純化………………………………………………………..14 （六）、基因重組後油體膜蛋白的表現…………………………………………..14 （七）、西方轉漬法………………………………………………………………..15 （八）、人造油體蛋白重組………………………………………………………..16 （九）、混濁度測試………………………………………………………………. 17 （十）、酵素水解切割試驗……………………………………………………......17 （十一）、耐熱穩定度以及結構穩定度測試………….………………………….17 第三章 結果與討論……………………………………………………………..... 18 （一）、漸進式剔除疏水性區域片段…………………………………………......18 （二）、微生物系統表達目標蛋白………………………………………………. 18 （三）、油體在顯微鏡下400倍的呈像…………………………………………. 19 （四）、油體穩定度測試…………………………………………………………. 19 （五）、不同pH值環境條件下的油體狀態…………………………………….. 20 （六）、不同溫度環境條件下的油體狀態……………………………………..... 20 （七）、蛋白水解酵素K切割油體膜蛋白…………………………………....... 20 第四章 討論…………………………………………………………………….....21 第五章 參考文獻……………………………………………………………........ 2