Molecular cloning and sequencing of the N gene of a watermelon isolate of tospovirus

TSWV西瓜分離株在之前即已被證實為TSWV-like 病毒，隸屬Bunyaviridae之Tospo- ▔▔▔ virus 屬，此病毒被命名為TSWV-W，與先前所發表的其他TSWV分離株大有不同。曾 ▔▔▔ 經嚐試以不同的純化方法去純化此病毒，然而一直無法得到足夠的病毒以構築其基 因庫(cDNA library)，故改由病毒ds RNA (replication form) 當作模板，以進行 cDNA選殖，由TSWV-W感染的煙草(Nicatiana rustica) 葉片組織中可純化到三種ds RNAs，分別為S (3.5kb)、M (5.8kb)及L (9.0kb) ，其中S 及M ds RNA的分子量亦 分別大於屬於L-血清型的分離株TSWV-NY 的S、M ds RNA 從 ds S RNA 所構築的基 因庫中得到一個包含整個N基因之轉譯架構(open reading frame, ORF) 的 cDNA clone pWN12。此clone全長1200個核甘酸，可對應產生一含275 個胺基酸，分子量 為30.25K的蛋白。將此病毒的N基因與其他已發表的三種TSWV分離株TSWV-L、TSWV -L3 及TSWV-I作比較，發現其核酸的序列僅有45.2－45.7﹪的類似度(similarity) ，而胺基酸序列之類似度更低於33﹪。CDNA clone pWN12在生體外可進行轉錄及轉 譯作用產生一31K 的蛋白，其與TSWV-W核鞘蛋白製備之血清有專一性反應。北方漬 染法分析中，以PWN12 所製備並以〔32P〕標誌的cDNA探針(probe) ，可在罹病組 織萃取的RNA 中，偵測到TSWV-W病毒基因體S RNA 長度的RNA 分子(3.5Kb) ，以及 二種大小約1.8Kb 及1.3Kb 長度的次基因體 RNA，利用此cDNA探針並可在感病的菸 草及回接的西瓜中，非常敏銳地偵測到病毒的基因體RNA 的存在。由本研究所發現 的TSWV-W許多特性中，諸如ds RNA分子的大小不同，核鞘蛋白的核甘酸及胺基酸序 列與其他TSWV分離株類似度甚低，以及TSWV-W所製備的核酸探針無法與L血清型 ( serotype) 進行雜合反應，加上先前在血清關係上的分析結果顯示TSWV-W確實是一 個不同於其它TSWV的單獨病毒，可列入Tospovirus中的第三個血清群 (serogroup)